Содержание

Красивые рамки для фотошопа

Фотошоп на русском — программа, предназначенная для быстрого редактирования фотографий и предоставляющая огромный простор для творчества. С ее помощью профессионалы и новички в создании художественного фото могут редактировать фотографии, создавать коллажи, календари и открытки.

Разработчики предусмотрели возможность применения множества оптических эффектов. Кроме ретуши, цветокоррекции и других стандартных функций фоторедактора, программа позволяет применять многие фотоэффекты, имеет обширный набор рамок для фотошопа, позволяет менять форму и размер изображения без ущерба для качества и имеет множество других возможностей. Все спецэффекты и элементы оформления можно легко совмещать и комбинировать друг с другом при обработке фото, создании календарей, коллажей и открыток.


Начало работы

Чтобы начать работу по совершенствованию ваших фотографий, нужно скачать фотошоп и установить его на свой компьютер. Интерфейс Домашней Фотостудии уже с первой минуты после открытия программы позволяет заняться творческой работой с фото, не теряя время на изучение функций, кнопок, инструментов и настроек.

Все, что от вас требуется — открыть фотографию в русском фотошопе и приступить к воплощению своих творческих идей!


Оформляйте фотографии под настроение

Ни в одном другом фоторедакторе нет больше возможностей для фантазийного оформления фотографий. Не нужно ничего дополнительно скачивать и устанавливать, в комплект Домашней Фотостудии уже входят красивые рамки для фотошопа в невероятном количестве. Вы можете оживить и украсить свои фотографии с помощью встроенных масок, оригинальных шаблонов и декоративных рамок различной тематики.

Чтобы начать применять к фотографиям готовые рамки из впечатляющей коллекции Фотошопа на русском, нужно щелкнуть по вкладке «Оформление» и найти в ней пункт «Добавить рамку». Перед вами откроется каталог креативных и ярких тематических шаблонов, в том числе здесь есть праздничные, романтические, детские рамки для фотошопа и множество других категорий. Каждая рамка отличается по характеру изображенных узоров, так что можно подобрать варианты для оформления семейных фотографий, снимков из отпуска и путешествий, праздничных фото, изображений детей и животных или портретов.

Кликнув мышью по понравившейся рамке в каталоге, вы получите красивое обрамление вокруг вашей фотографии, которое подчеркнет ее уникальность. Изменяйте глубину выбранной рамки, передвигая специальный ползунок. Для проверки результата периодически нажимайте на кнопку «Просмотр».


Добавьте стиля фотографиям

Для творческой обработки фотографий в Домашней Фотостудии имеются готовые решения для оформления, а также возможность индивидуально подобрать к любому изображению подходящие трехмерные контуры или маски, предназначенные для креативной обработки краев снимка. Чтобы сделать фотографию еще более стильной, можно использовать более сотни различных эффектов, которые способны преобразить любое изображение.

Комбинируя встроенные рамки, эффекты, фильтры и маски, простой снимок можно превратить в фантастическое изображение, сделать визуальный акцент на атмосфере фотографии и подчеркнуть вашу творческую задумку.


Работайте в фоторедакторе с удовольствием

Использование Домашней Фотостудии снимает вопрос, как научиться пользоваться фотошопом, так как эта программа создана для быстрого и простого решения наиболее распространенных практических задач, таких как размытие и замена фона, повышение контраста, цветокоррекция, очистка от шума, художественная обработка фото и т. п. Все функции и инструменты просты в освоении и позволяют улучшать снимки любого качества одним кликом мыши.

Понравилась статья? Расскажите друзьям:

Рамки кадров и формы баллонов в adobe photoshop « Мангалекторий


 

Существуют различные программы для рисования комиксов и манги, но сегодня мы поговорим о наиболее распространённом  графическом редакторе  –  Adobe Photoshop. Он многофункционален и может пригодиться в таком деле, как создание рамки кадра или формы баллона, о чём вам расскажет muha.

 

Многие художники предпочитают рисовать комиксы сразу в Photoshop ввиду его популярности. А поскольку эта программа создавалась в первую очередь для работы с фотографиями, то при рисовании в ней комикса встаёт вполне закономерный вопрос: «Как оптимально и быстро делать рамки кадров?» Оптимальный способ действительно есть. Рассмотрим всё по порядку.

    1. Создаем лист нужного размера с разрешением 300 dpi минимум. Многие художники предпочитают 600 dpi, но стандарт для печати на офсетной или цифровой машине 300 dpi, поэтому этого более чем достаточно. Если же Вы рисуете мангу под печать на ризографе, то разрешение должно быть 600 dpi. Сам лист лучше делать не меньше А4. Уменьшить картинку всегда можно, а вот увеличить без потери качества уже не получится.
    2. Итак, лист создан. Теперь делаем набросок своей будущей страницы, на котором размещаем все кадры, сцены, расположение диалогов и звуков. Вот теперь и начинается самое интересное – рисование рамок. В Manga Studio это делается относительно просто, здесь же придется проявить смекалку.
    3. Можно просто провести ровные линии с помощью кисти с прижатой клавишей Shift. Но тогда могут быть неровные углы кадров, к тому же для исправления неудачной рамки придется все стирать и рисовать заново. Существует более простой и удобный способ – использование кривых. С помощью инструментов Rectangle Tool (U) или Pen Tool (P) рисуем примерное расположение рамок. Настройки инструментов показаны на картинке ниже (они одинаковы для любого инструмента).

Если нужно сделать два кадра одинакового размера, можно просто скопировать созданный путь с помощью инструмента Path Selection Tool (A). Для изменения формы кадра или перемещения части узловых точек используется инструмент Direct Selection Tool (A).

Если на странице есть кадры, рамки которых наезжают на рамки других кадров, то их следует делать на отдельном слое путей. Слой создается в палитре Paths (Window > Paths).


4. Все кадры стоят на своих местах, значит можно делать обводку. Для этого берём инструмент

Brush Tool (B) и выбираем кисть нужной формы и диаметра. Например, я часто использую обычную круглую кисть с диаметром 8-10 пикселей. Диаметр кисти равен ширине рамки кадра.


Cоздаем отдельный слой для рамок. Затем выделяем все рамки с помощью инструмента Path Selection Tool (A), нажимаем правую кнопку мыши и выбираем в появившемся меню пункт Stroke Path (или Stroke Subpath, если выделены не все пути). В появившемся окне выбираем обводку кистью и убираем галочку с пункта

Simulate Pressure (иначе обводка будет не равномерной, а постепенно утончающейся). Нажимаем ОК и вуаля: рамки готовы.


Чтобы нарисовать рамки, расположенные над другими рамками, мы создаем еще один слой и проделываем всю вышеописанную процедуру для другого слоя путей. Чтобы удалить линии, которые перекрываются верхними рамками, выделите еще раз путь верхней рамки, кликните по нему правой кнопкой мыши и выберите пункт Make selection (настройки указаны на картинке слева).   Затем перейдите на слой нижних рамок и нажмите клавишу Delete – лишние линии будут стерты. Если пути больше не нужны, их можно удалить. Но лучше их оставить на случай, если понадобиться что-то изменить. Баллоны для текста я рисую таким же образом.

5. Когда рамки готовы, можно начинать рисовать. Если выезжающие за пределы рамок элементы кадров раздражают и надоедает постоянно их стирать, можно сделать две вещи. Первая – просто выделить область кадра и рисовать внутри выделения.


6. Другой способ чуть сложнее, но эффективнее – область каждого кадра можно ограничить маской. Для этого активируем наши пути (вот для этого-то они и не удаляются), выбираем путь инструментом Path Selection Tool (A), нажимаем правую кнопку мыши и выбираем в появившемся меню пунктCreate vector mask. Маска будет создана для текущего кадра или группы. Все, что выходит за пределы маски, не будет отображаться. Саму маску можно редактировать простым ластиком или кистью.


Если Вы выбираете способ с масками, то путь каждого кадра следует рисовать на отдельном слое, поскольку маска создаётся для всех путей на текущем слое.

 

КАК РИСОВАТЬ БАЛЛОНЫ В ADOBE PHOTOSHOP

 

1. На панели слева выбираем инструмент Rectangle Tool (U), или Rounded Rectangle Tool, или Ellipce Tool, всё зависит от того, какой формы баллоны вы предпочитаете.

Способ рисования ставим Path.

Для Rounded Rectangle Tool можно настроить размер закругления углов, это делается в окошке Radius в настройках инструмента.


2. Затем рисуем баллон вокруг готового текста. Размер баллона потом можно изменить, для этого нужно нажать правой кнопкой мыши на нужном пути и выбрать пункт Free Transform Path. Лучше не использовать это для прямоугольников с закруглёнными углами, радиус закругления тоже меняется.

3. Теперь выделяем пути с помощью инструмента Path Selection Tool (A), кликаем на них правой кнопкой мыши и выбираем пункт Stroke Path… В появившемся окне выбираем кисть для обводки и нажимаем OK.

Теперь баллоны имеют контур.

При обводке учитывается размер и цвет текущей кисти; Если нажать Simulate Pressure, то контур будет не замкнутым; Контур будет нарисован на текущем слое.


 

 

4. Затем снова вызываем контекстное меню и выбираем Make Selection.


 

 

Создаём слой под слоем с контуром баллонов и заливаем полученную область выделения любым цветом. Их потом можно будет легко перекрасить.

 


 

5. Убираем выделение и создаём новый слой для хвостиков. Берём инструмент Pen Tool (P). Затем рисуем путь для хвостов баллонов и обводим так же как обводили сами баллоны в пункте 3. Для завершения пути достаточно нажать ESC и можно рисовать следующий путь, он не будет связан с предыдущим. Неудавшиеся узловые точки можно потом поправить с помощью инструмента Direct Selection Tool (A).


 

6. Стираем всё лишнее со всех слоёв и склеиваем слои обводки баллонов и их хвосты. Затем красим хвосты вручную кистью либо с помощью выделения на слое с цветом баллонов. Баллоны готовы =) Остались мелочи.


 

 

7. Баллоны можно покрасить в нужный цвет, если это не было сделано. И добавить тексту эффекты (опять же по желанию).

Существует множество других способов рисования баллонов и это отнюдь не самый простой из них. Лучше всего рисовать баллоны от руки, но если хроническое криворукие не получается излечить, можно попробовать такой метод. А ещё можно рисовать мангу в Manga Studio…

 

Первая публикация: muha. Рамки кадров в Adobe Photoshop

Ruscomix magazine. – № 1. – 2011. С. 54-55.

Автор: muha

Простая рамка в фотошопе. Способ 2

Здравствуйте, друзья!

Надеюсь, что вы не запутались в моем первом уроке по созданию простых рамок, и хоть немного потренировались и уже немного разбираетесь с интерфейсом и инструментами фотошопа.

Сегодня я хочу вам показать еще один способ создания простой рамки. Даже два.

Я пользуюсь ими иногда, если мне надо изменить какую-то фотографию, позаимствованную в интернете, и если эта фотография мне крайне необходима в статье.

Первый — с использованием подложки, второй — непосредственно с самой рамкой, но оба этих действия объединены одной функцией — первоначальным УВЕЛИЧЕНИЕМ РАЗМЕРОВ ХОЛСТА картинки.

Этот урок я специально сделала на примере той же фотографии, которую обрабатывала в прошлом уроке, чтобы у меня была возможность показать здесь первые скриншоты, и напомнить вам первые шаги работы в фотошопе, которые скоро у вас будут доведены до автоматизма, потому что без этих действий не начинается ни одна работа в программе.

В процессе нового урока по созданию рамки в фотошопе я покажу вам один из способов обрезки картинки, так что вы изучите еще один инструмент фотошопа на практике.

Итак, начинаем.

1. Вспоминаем урок по открытию файлов, и первые шаги прошлого урока. Напоминаю ваши действия Меню — Файл — открыть.

2. В дополнительном окне ищем нужную фотографию. Подробно описывать ваши действия уже не буду. В прошлых уроках они есть.

3. Картинка появляется в рабочем поле программы. Преобразуем фон в слой, или снимаем замок.

В итоге этих действий видим такую картинку.

В этот раз я не стала переименовывать Слой 0, так как в этой работе слоев не особенно много. Но вы можете это сделать, так сказать для практики, просмотрев прошлый урок.

4. Для этого урока я решила не использовать всю фотографию, а только ее часть. Захотелось выделить и вырезать чудесные желтые тюльпаны. Чтобы показать вам на практике как работает инструмент Прямоугольная область. При нажатии на него левой кнопкой мыши 1 раз инструмент становится активным

Устанавливаем + в то место фотографии, с которого нужно начинать выделение, и «рисуем» нужный кусок. Выделенный объект будет ограничен пунктирными линиями.

С таким выделением в центре при задействовании клавиши Delete удалится середина фотографии, а нам нужно обрезать ее край.

Вот здесь  нужна функция ИНВЕРСИЯ выделения.

Немного теории… Эта функция — наиболее часто используемая операция. Для этого идем в Меню — Выделение — Инверсия, всегда после того, как на картинке было выполнено любое выделение. После применения инверсии выделения произойдет обратное действие (так и переводится слово инверсия). Невыделенная область, которую надо удалить или произвести с ней какие-то другие действия, станет выделенной.

Так у меня и получилось.

Удаляем область выделения клавишей Delete.

А теперь удаляем излишки прозрачного фона, активизируя функцию Тримминг (Меню — Изображение — Тримминг). Для любителей собак это слово известное. Обрезать — вот что оно означает. В Фотошопе тоже.

В дополнительном окне жмем на ОК, не меняя настроек по умолчанию.

5. Получили картинку, вокруг которой будем делать простую рамку. Вы помните, что моя исходная фотография была очень большой (4000 на 3000 пк). Проверим, каким стал ее размер после наших действий. Идем в Меню — Изображение — Размер изображения и кликаем левой кнопкой мыши. Как оказалось, у меня получилось 2220 на 1980 пикселей.

Уменьшим размер до 700 пикселей по ширине, как в прошлом уроке. Высота изменится автоматически. Жмем на ОК.

Как видите, при масштабе картинки 100%, она заняла все рабочее поле.

Уменьшим масштаб до 80%, чтобы было видно то, что мы делаем.

6. А вот теперь увеличим размер холста, чтобы вокруг картинки получилось обрамление. Идем в Меню — Изображение — Размер холста. Кликаем левой кнопкой мыши.

Добавляем по ширине и высоте по 50 пикселей. Вы можете задать свои размеры.

Прописываем нужные цифры в соответствующих окнах ширины и высоты и жмем ОК.

Как видите, возле картинки получилась прозрачная область одного размера со всех сторон.

7. Теперь будем делать подложку для фото, это может быть заменой привычной рамки.

Создаем новый слой. Напоминаю, что для этого нужно кликнуть левой кнопкой по значку внизу панели слоев.

Теперь Слой 1 у нас активный (синий). Перетаскиваем новый слой под фото, зажав левую кнопку мыши, не отпуская его до завершения перемещения.

И давайте вспомним материал прошлого урока и переименуем Слой 1 в  слой Подложка. Правой кнопкой кликаем по слою 1 и левой кнопкой по фразе Параметры слоя.

Пишем новое название слоя и жмем на ОК.

Я решила сделать подложку в цвет серединки тюльпанов. Активизируем инструмент ПИПЕТКА и кликаем по нужному месту. Вы можете выбрать любой цвет, какой вам понравится. Основной цвет в панели инструментов тоже сменится.

Активизируем инструмент ЗАЛИВКА, и левой кнопкой мыши кликаем по картинке в рабочем поле. В панели слоев вы увидите, что слой Подложка окрасился равномерно, а на рабочем поле — только по краю. Этого мы и добивались.

Теперь немного добавим «выпуклости» самой картинке. Я решила  создать на Подложке ее тень. Для этого жмем 2 раза левой кнопкой по активному слою (тюльпаны) и в Стиле слоя — маркер Тень и ОК.

По умолчанию в программе задана тень черного цвета.

Я решила изменить ее цвет. Вы можете оставить по умолчанию, а можете поучиться со мной.

Итак, жмем левой кнопкой на слово тень, и открываются ее параметры. Кликните по черному окошку левой кнопкой, и появится окно для выбора цвета тени. Я, как правило выбираю тень инструментом ПИПЕТКА, в данном случае взяла цвет подложки и выбрала более темный подходящий цвет, жмем на ОК, и в стилях слоя тоже на ОК. Цвет тени на подложке изменится.

Эта часть работы с готова.  Сохраним в таком варианте чуть позже. Теперь отключим видимость слоя подложка, кликнув по «глазку».

8. А теперь сделаем непосредственно рамочку вокруг картинки.

Активный слой — Слой 0. Нам нужно выделить прозрачное поле вокруг фото. Для этого активизируем инструмент ВОЛШЕБНАЯ ПАЛОЧКА и кликнем ею по прозрачному фону, после чего он выделится с внутренней и наружной стороны.

Рамочку будем создавать на новом слое, для чего его создаем, кликнув по значку с уголком в панели слоев, и назовем этот слой Рамка.

Выделение прозрачного фона активное и можно теперь на слое Рамка выполнить заливку. Я буду использовать функцию ЗАЛИТЬ из меню программы (Меню — Редактирование — Выполнить заливку).

Я постараюсь подобрать какой-то симпатичный цвет. В дополнительном окне жмем на ЦВЕТ.

В окне Выбрать цвет можно выбрать цвет визуально, а можно активизировать инструмент ПИПЕТКА. Я так и сделала, и кликнула по листикам тюльпанов. Жмем на ОК в выборе цвета, и в окне Заполнить.

P.S. : Для окрашивания рамки можно использовать также инструмент ЗАЛИВКА. Так что у вас есть выбор.

При использовании инструмента ЗАЛИВКА будет использован Основной цвет. Значит, цвет рамки нужно будет подобрать заранее.

Ну вот, снимаем выделение.

И делаем рамку выпуклой. Способов множество, но я выбрала самый простой. Я сделаю ее тиснение.

Кликаем 2 раза левой кнопки по активному слою Рамка, переходим в Тиснение. Я оставила параметры по умолчанию. Вы же можете ими поиграть. Жмем на ОК и рамочка готова.

9. Теперь осталось подписать свою работу.

Активизируем инструмент Текст. Цвет текста я взяла желтый. Он хорошо подходит и к оранжевой подложке, и к зеленой рамке.

Ставим маркер в нужное место, пишем сам текст, и жмем на слой Т в панели слов левой кнопкой для завершения процесса написания. В случае необходимости перетаскиваем текст в нужное место инструментом ПЕРЕМЕЩЕНИЕ.

Я не люблю очень яркие подписи авторства, поэтому непрозрачность ТЕКСТА сделала 50%.

Теперь можно и урокзавершать. Сделала все, что хотела: фото на подложке и фото в простой рамке.

10. Сохраняем картинку с рамкой.  Напоминаю, идем в Меню — Файл — Сохранить для Web и устройств.

Чтобы сохранить картинку с подложкой и подписью, надо отключить видимость слоя Рамка, и сохранить работу, как  сказано выше.

А вот и мои картинки.

Фото на подложке.

Фото в рамке.

Надеюсь, что этот урок будет для вас понятным и интересным.

Если возникнут трудности, то пишите на е-мейл или в комментариях, разберемся. Желаю вам удачи и творческого вдохновения.

Как сделать рамку для текста в фотошопе с помощью ободки и выделения — Photoshop

Если ты являешься новичком в изучении программы Adobe Photoshop,то даже простейшие вещи могут вызвать затруднение. И ладно бы написать текст, есть специальный инструмент для этой операции. Но порой приходится задействовать не только знания, но и логику. Для того чтобы сделать рамку для текста придется задействовать несколько операций. Давайте разберемся, какие именно.

Для начала создадим рабочий документ. Размер практически не имеет значения, лишь бы вам было удобно. И сразу же создадим новый слой при помощи комбинации клавиш ctrl+shift+n.

Напишем текст. Думаю, вы уже знаете, какой инструмент вам в этом поможет, но на всякий случай я напомню. Для написания нашей фразы используем инструмент «текст» на боковой панели.

Теперь давайте примемся за рамку. Я сделаю простенький монохромный вариант, но вам советую подключить фантазию и продвинуться немножко дальше.

Создаем новый слой, той же комбинацией клавиш ctrl+shift+n. А теперь выбираем инструмент прямоугольная область и «обводим» наш текст.

Не пытайтесь проделать эту операцию идеально ровно. Рамку для текста мы еще выровняем. Но позже.

Теперь обведем рамку. Для этого на верхней панели ищем «редактировать» — «выполнить обводку».

Как видите, вариаций настроек тут довольно много. Вы можете пофантазировать и украсить свою рамку для текста по всему усмотрению. Как видите, обводка может располагаться с разных сторон вашего выделения. Цвета и режим наложения тоже вполне можно заменить. Я выбрала вот такие настройки:

Теперь нам следует снять выделение с рамки. Вы можете воспользоваться как соответствующей командой на верхней панели во вкладке «выделение», так и комбинацией клавиш ctrl+d.

Прежде, чем приступить к выравниванию рамки и текста, хочу заметить, что не следует изменять размер рамки в этом случае. Потому что толщина линии тоже будет меняться, и толщина обводки на вашей рамке станет неоднородной.

Итак, приступим к выравниванию. В окне слоев выбираем исходный слой — подложку. Он будет вторым по счету.

Вам следует расставить направляющие (линейки) по появившимся маркерам снизу и сверху. Если вы не знаете, как это сделать, здесь можете изучить подробнее.

А теперь в том же окне слове выбираем поочередно слой с надписью и рамкой и выравниваем их по направляющим.

Посмотрим, какая рамка для оформления текста в фотошопе у меня вышла.

Часто слышу вопрос, как вставить текст в рамку в фотошопе. Возможно, кто-то имеет ввиду уже готовую рамку. Думаю, вы уже догадываетесь, что для этого вам следует выполнить те же действия, но в несколько другом порядке.

  • Создать рабочую область и новый слой.
  • Вставить рамку на исходный документ
  • Написать текст
  • Выровнять их

Вот так все просто и незамысловато.

Рамки для Фотошопа на прозрачном фоне

Чтобы обычная фотография получилась красивой и необычной, к ней можно добавить рамку. Сделать это можно в программе Фотошоп. Рамка должна быть на прозрачном фоне, чтобы её можно было наложить на фото. Чтобы не делать для каждой рамки прозрачный фон, можно воспользоваться готовыми рамками, которые уже выполнены на прозрачном фоне.

Представляем подборку рамок для Фотошопа на прозрачном фоне, которые сделают ваши фотографии красочными и запоминающимися.

Прозрачные рамки для Фотошопа

Начнём с простых прозрачных рамок для программы Photoshop:

За каждую отдельную рамку, которая выполнена на прозрачном фоне, отвечает свой слой.
Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Фоторамки для фотошопа №1

В архиве вы найдёте изображение с рамками и шаблон для программы Photoshop, в котором в виде отдельных слоёв представлена каждая рамка. Шаблон большого разрешения (точек на дюйм), поэтому если у вас слабый компьютер — придётся немного подождать при открытии этого файла.

Ещё одна подборка простых рамок с цветами, только как изображения в формате PNG (прозрачный фон) — их также можно использовать в Фотошопе:

Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Фоторамки для фотошопа №2

Новогодние рамки для Фотошопа 2016

В преддверии Нового года 2016, особенной популярностью пользуются новогодние рамки для Фотошопа. Используя новогоднюю рамку, можно сделать отличный подарок себе и своим близким, а также оригинально поздравить родственников с Новым годом.

Новогодние рамки 2016:

Это не столько рамки, сколько набор изображений новогодних атрибутов: новогодные веночки, банты, мишура и шарики. Используя эти красочные картинки вы сможете сделать из обычного фото настоящий новогодний шедевр.
Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Новогодние фоторамки для фотошопа №1

А вот эта подборка состоит из одних новогодних рамок 2016 для Фотошопа:

Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Новогодние фоторамки для фотошопа №2

Рамки для Фотошопа с Днем рождения

Оригинально поздравить с Днём рождения помогут красочные рамки для Фотошопа на прозрачном фоне:

Веночки из цветов, цветы, бабочки — всё это можно использовать отдельно, чтобы сделать по-настоящему оригинальную фотографию на День рождение.
Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Фоторамки для Фотошопа на День рождения №1

Рамки на прозрачном фоне в тему День рождения:

Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Фоторамки для Фотошопа на День рождения №2

Фоторамки для Фотошопа детские

В завершении статьи — рамки с прозрачным фоном для детских фотографий:

Скачать бесплатно (с Яндекс.Диска): Фоторамки для Фотошопа детские

Как вставить фото в рамку в Фотошопе

Вставить фото в рамку в Фотошопе можно также, как вставляется фото в фото в этой программе.

Использование масок-вырезов в Photoshop. — prisskazka — ЖЖ

Наверняка в сети Вам попадались такие штучки: (маски на превью не мои, взяты из сети для примера)
Такие заготовки используются для создания фигурных вырезов под фото в дизайне цифровых рамочек для фото, различных виньеток, а также скраповых страничек. В этом уроке я опишу три простых способа работы с масками-вырезами в Photoshop.

Способ 1 – сохраняем «как кисть».

Открываем маску в фотошопе. Они бывают в PNG или JPG формате, для сохранения в виде кисти это не имеет значения. Зато нужно, что бы наша маска была чёрного цвета (в противном случае она может сохраниться полупрозрачной, что не есть правильно), фон же, если он есть, обязательно белый.

Идём в «изображение-размер изображения» (максимальный размер кисти в программе – 2500px), при необходимости уменьшаем размер.

Жмём «редактировать-определить кисть». Наша новая кисть сохранится в палитре кистей (в самом низу).

Теперь, чтобы сделать вырез, Вам нужно выбрать инструмент «ластик» со 100-процентной непрозрачностью, затем подцепить эту кисть, отрегулировать размер и кликнуть на фоновом слое. Вырез готов.

Также кисть маску можно использовать при работе инструментом «штамп», (используя кисть, взять образец со слоя с фото и создать отпечаток на новом прозрачном слое, а исходной картинке отключить видимость) – в этом случае Вы получите уже вырезанный фрагмент фотографии.

Способ 2 – «обтравочная маска».

Для этого способа маска обязательно должна быть в формате PNG, а вот её цвет не имеет никакого значения.

Открываем фон и маску в Photoshop. Перетаскиваем маску, как слой, помещаем над фоном и располагаем так, как нравится. Открываем фотографию, которую хотим наложить с фигурной обрезкой и перетаскиваем в документ с фоном и маской (над слоем с маской). Идем в палитру слоёв, выделяем слой с фото, жмём правую кнопку мыши и выбираем из выпадающего списка «создать обтравочную маску». Фотография обрежется и будет видна только внутри контуров маски.

Бывает так, что какой-то край заготовки оказался не заполнен фотографией или же наоборот – обрезалась важная часть снимка. Что бы всё поправить, нужно воспользоваться инструментами трансформации («редактирование-трансформация-свободная трансформация»), применить который можно как к фотографии, так и к маске. При использовании этого инструмента не забывайте держать нажатой клавишу «Shift», что бы случайно не исказить пропорции. Также, Вы можете передвигать и трансформировать маску вместе с фото, предварительно связав их.

Способ 3 – выделение через каналы.

Здесь тоже не важно, какой формат маски Вы используете (подходит и PNG, и JPG).

Именно этот способ я применяю чаще всего для изготовления виньеток и рамок.
Как и во втором случае, открываем фон в Photoshop, кадрируем (если нужно) и перетаскиваем туда же нашу маску. Подгоняем её по размеру. Разблокируем фоновый слой двойным кликом (в открывшемся окне нужно подтвердить это желание – жмём «ОК»), затем отключаем этому слою видимость.

Переходим на вкладку «каналы», жмём (значок этого действия выглядит как кружок из точек) и получаем выделение. Удаляем или отключаем слой с маской. Возвращаемся в панель слоёв, перемещаемся на слой с фоном и жмём «Delete». Вырез готов.

Вот и всё. Удачи!

Репродуктивные гормоны — Best Tests Issue 18

Каковы основные репродуктивные гормоны?

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ)

Лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) являются важными гормонами гипофиза, необходимыми для репродуктивной функции. процессы как у мужчин, так и у женщин. ЛГ и ФСГ высвобождаются передней долей гипофиза в ответ на пульсирующее высвобождение гонадотропина. стимуляция гормона (ГнРГ) гипоталамусом и отрицательная обратная связь эстрогена или тестостерона.

У женщин комбинированное действие ФСГ и ЛГ стимулирует рост фолликулов яичников и стероидогенез, при этом производство андрогенов, которые затем превращаются в эстрогены под действием фермента ароматазы. Всплеск в середине цикла в ЛГ также вызывает овуляцию. Уровень ФСГ обычно повышается во время менопаузы, потому что яичники становятся менее отзывчивыми. на ФСГ, который заставляет гипофиз увеличивать производство ФСГ. Однако колебания активности яичников, особенно в начале перименопаузы означает, что уровни ФСГ и эстрадиола не являются надежными предикторами менопаузы, как это иногда бывает на пременопаузальном уровне.

У мужчин ФСГ стимулирует клетки Сертоли, вызывая сперматогенез, а ЛГ вызывает интерстициальные клетки Лейдига. яичек для выработки тестостерона.

Диапазон значений
Референсный диапазон для ФСГ и ЛГ у взрослых женщин: 1
Нормативный диапазон для ФСГ у взрослых мужчин составляет 2–12 МЕ / л, а для ЛГ — 2–9 МЕ / л. 1

Фаза ФСГ (МЕ / л) ЛГ (МЕ / л)
Ранний фолликулярный 3–10 2–8
Пик в середине цикла 4–25 10–75
Постменопаузальный > 20 > 15
Беременность <1 2–9

Эстрадиол

Эстрадиол является основным эстрогеном у женщин, у которых происходит овуляция, и доминирующим гормоном яичников во время фолликулярной (первая) фаза менструального цикла.Концентрация эстрадиола меняется на протяжении менструального цикла. Эстрадиол высвобождается параллельно с ростом фолликулов и достигает максимума при созревании фолликула (до овуляции). Эстрадиол продукция постепенно снижается, если ооцит, выделяемый фолликулом, не оплодотворяется. Лабораторные исследования обычно измеряют E2 формы эстрадиола, большая часть которых связана с глобулином, связывающим половые гормоны (SHBG). Уровень эстрадиола значительно снижается во время менопаузы.

У мужчин эстроген является важной частью репродуктивной системы и необходим для созревания сперматозоидов. Начальный гипогонадизм (нарушение реакции на гонадотропины, включая ЛГ и ФСГ) может привести к повышенной секреции яичек эстрадиол и повышенное превращение тестостерона в эстрадиол. Ожирение также может повышать уровень эстрогена у мужчин. 3 An увеличение соотношения эстрогенов и андрогенов у мужчин связано с гинекомастией (развитие груди ткань).

Диапазон значений
Референсный диапазон эстрадиола для взрослых женщин составляет: 1

.
Фаза Эстрадиол (пмоль / л)
Ранний фолликулярный <300
Овуляторный всплеск <500–3000
Лютеиновая волна 100–1400
Постменопаузальный <200

Н.B. Уровни эстрадиола обычно не определяются у женщин, использующих оральные контрацептивы, содержащие эстроген, поскольку это подавляет производство эстрадиола из яичников. Уровни эстрадиола у женщин, принимающих некоторые формы ЗГТ (например, валерат эстрогена) будет высоким.

Референсный диапазон эстрадиола для взрослых мужчин зависит от анализа, поэтому рекомендуется проконсультироваться в местной лаборатории. Пример эталонного диапазона эстрадиола для взрослых мужчин составляет 0–200 пмоль / л. 1

Прогестерон

Прогестерон — это доминирующий гормон яичников, секретируемый во время лютеиновой (второй) фазы менструального цикла. Его основная функция — подготовить матку к имплантации эмбриона, если во время этого произойдет оплодотворение. цикл. Если наступает беременность, высвобождается хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), который поддерживает желтое тело, которое в Turn позволяет уровню прогестерона оставаться повышенным.Примерно на двенадцатой неделе беременности плацента начинает производить прогестерон вместо желтого тела. Уровень прогестерона снижается после родов и во время кормления грудью. Прогестерон уровни низкие у женщин после менопаузы. У мужчин почти весь прогестерон превращается в тестостерон в яичках.

Нет показаний, кроме исследования фертильности у женщин (при некоторых обстоятельствах), для которого требуется прогестерон. измерение в условиях общей практики.

Диапазон значений
Обнаружение овуляции — измерение на 20-23 день нормального 28-дневного цикла:
Референсный диапазон прогестерона у взрослых мужчин составляет 1

.
0-6 нмоль / л овуляция маловероятна
7-25 нмоль / л Возможна овуляция
> 25 нмоль / л овуляция вероятна

Пролактин

У женщин после введения эстрогена пролактин стимулирует выработку молока в груди.Во время беременности пролактин концентрации начинают увеличиваться примерно на шестой неделе беременности, достигая пика на поздних сроках беременности.

У мужчин и небеременных женщин секреция пролактина гипофизом подавляется гипоталамической выброс дофамина. Опухоли или образования, которые приводят к сдавлению ножки гипофиза, или препараты, блокирующие дофамин. рецепторы, например психотропы, опиаты и агонисты дофамина могут вызывать гиперпролактинемию за счет снижения доставки дофамина в гипофиз.Гипотиреоз также может быть связан с гиперпролактинемией, если уровень тиреотропин-рилизинг-гормона (TRH) повышаются, что стимулирует выработку пролактина.

Гиперпролактинемия — наиболее частое эндокринное заболевание гипоталамо-гипофизарной системы, вызывающее бесплодие. у обоих полов. Пролактин-секретирующие опухоли (пролактиномы) являются наиболее распространенным типом опухолей гипофиза. Обычно это небольшие опухоли (микропролактиномы) и характеризуются ановуляцией или другими нарушениями менструального цикла, галактореей (секреция молока из груди) и сексуальная дисфункция.В редких случаях опухоли могут быть большими (макропролактиномы) и присутствовать с такими симптомами, как головные боли и битемпоральная гемианопсия (отсутствие зрения во внешних половинах поля зрения).

N.B. Галакторея может возникать у мужчин, но это гораздо менее распространенный симптом высокого пролактина у мужчин.

Диапазон значений
Уровень пролактина колеблется в течение суток, а уровень в сыворотке крови самый низкий примерно через три часа после просыпаться.Образцы лучше всего собирать во второй половине дня. 1 Стресс или болезнь также могут повышать уровень пролактина, поэтому в идеале пациенты должны быть здоровыми и не принимать лекарства, которые могут влиять на уровень пролактина, такие как психотропы, опиаты или агонисты дофамина.

Референсные диапазоны

зависят от конкретного анализа, поэтому рекомендуется проконсультироваться с местной лабораторией, чтобы узнать их референсный диапазон. Пример референсного диапазона для пролактина составляет 50–650 мЕд / л для взрослых женщин и 50–450 мЕд / л для взрослых мужчин. 1

Примерно у 10% пациентов повышение общего пролактина может быть связано с связыванием пролактина с другим белком сыворотки (макропролактином). 1 В у этих пациентов, если небольшой биологически активный пролактин находится в пределах нормы, повышенный пролактин обычно может можно рассматривать как лабораторный артефакт. Лаборатории обычно проверяют эту возможность у новых пациентов с необъяснимая гиперпролактинемия.

Повышенный уровень пролактина обычно связан со снижением уровня эстрогена или тестостерона.

Тестостерон

Тестостерон — это основной андроген, отвечающий за развитие и поддержание мужских половых признаков. Он также стимулирует анаболические процессы в несексуальных тканях. У мужчин ЛГ стимулирует клетки Лейдига в семенниках к производят тестостерон. Небольшое количество тестостерона у мужчин вырабатывается надпочечниками.

У женщин большая часть тестостерона вырабатывается путем периферического превращения стероидов-предшественников андрогенов в тестостерон, остальная часть вырабатывается яичниками и надпочечниками.Уровни циркулирующего тестостерона колеблются в зависимости от менструальный цикл и увеличение при беременности. Уровни тестостерона в сыворотке остаются относительно стабильными во время и после климакс. 4 Синдром поликистозных яичников — наиболее частая причина гиперандрогении (повышение уровня тестостерона уровни) у самок. Более редкие причины включают синдром Кушинга, врожденную гиперплазию надпочечников и опухоли, секретирующие андрогены.

Диапазон значений
Референсный диапазон общего тестостерона у взрослых мужчин различается в разных лабораториях.Примерный диапазон составляет 8-35 нмоль / л. Если единичный уровень тестостерона ранним утром явно находится в пределах нормы (например,> 15 нмоль / л) тогда дальнейшее тестирование не требуется. Если получен низкий или пограничный результат, подтверждающий тест рано утром (когда пациент здоров).

Контрольные диапазоны

тестостерона для женщин также зависят от конкретного анализа. Пример эталонного диапазона взрослой женщины для общий тестостерон равен 0.5 — 2,5 нмоль / л. 1 Современные анализы тестостерона второго поколения обычно имеют более низкую колеблется у женщин из-за меньшего вмешательства со стороны других стероидов, таких как DHEAS

Свободный тестостерон можно рассчитать из общего тестостерона и глобулина, связывающего половые гормоны (SHBG). Однако ГСПГ тестирование требуется только в редких случаях, например, при нарушениях связывания половых гормонов (например, гипертиреоз, противосудорожные препараты). употребление, тяжелое ожирение) может ввести в заблуждение уровень общего тестостерона.Обсуждение с эндокринологом или химиком перед обращением в ГСПГ рекомендуется обратиться к патологу.

Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ)

ХГЧ структурно и функционально идентичен ЛГ, за исключением его бета-цепи, поэтому его часто называют как бета-ХГЧ (или β-ХГЧ).

ХГЧ выделяется клетками трофобласта во время беременности. Эти клетки образуют внешний слой развивающейся бластоцисты. после зачатия и эмбриональной имплантации.ХГЧ стимулирует выработку прогестерона желтым телом и увеличивает васкуляризация между трофобластом и стенкой матки. Выявляется примерно через три дня после имплантации. эмбриона, что происходит примерно через шесть-двенадцать дней после овуляции и оплодотворения. Во время нормальной беременности Уровень ХГЧ обычно удваивается примерно каждые два дня, затем выходит на плато и начинает снижаться через восемь-десять недель, но будет оставаться повышенным на протяжении всей беременности. 5 Женщины, беременные двойней, как правило, производят более высокие уровни ХГЧ, чем у одиночных эмбрионов, но уровень ХГЧ не может быть надежно использован для прогнозирования этого. 6

Измерение уровня ХГЧ в моче или сыворотке можно использовать для подтверждения беременности на ранних сроках (в большинстве случаев уровень ХГЧ в моче достаточен). Сыворотка ХГЧ также может быть полезен в качестве первоначального исследования у женщин, у которых есть симптомы, которые могут указывать на внематочную беременность, выкидыш. или трофобластическое заболевание. Трансвагинальное УЗИ можно использовать примерно после пяти недель беременности или при уровне ХГЧ> 1000. — 2000 МЕ / л, для выявления признаков беременности. 7

На нежизнеспособную беременность может указывать снижение или плато уровня ХГЧ на ранних сроках беременности (помня, что ХГЧ снижается при нормальной беременности примерно после девяти-десяти недель беременности). Однако сам по себе ХГЧ не является надежным прогностический фактор внематочной беременности, поскольку нет определенной модели уменьшения или увеличения числа беременностей.8 После выкидыша это может требуется три или четыре недели, чтобы уровни ХГЧ вернулись к уровням небеременных (7 При неполном выкидышах, Уровень ХГЧ может оставаться повышенным, и может потребоваться хирургическое вмешательство.

У мужчин ХГЧ продуцируется некоторыми опухолями яичек, и поэтому он используется в качестве сывороточного онкомаркера для некоторых форм. рака яичек.

Диапазон значений
Уровень ХГЧ на ранних сроках беременности может варьироваться в широком диапазоне. Скорость увеличения, т. Е. Удвоения время дает больше полезной информации, чем фактические уровни. Большинство анализов мочи дают положительные результаты при уровне ХГЧ> 20-25. МЕ / л. Сыворотка ХГЧ 1

Чрезмерно высокий уровень ХГЧ, e.грамм. > 100000 МЕ / л может указывать на гестационную трофобластическую болезнь, например коренной зуб беременность.

Когда следует исследовать репродуктивные гормоны?

Есть несколько показаний для измерения уровня репродуктивных гормонов, однако в условиях общей практики наиболее частыми причинами являются исследование первичной или вторичной аменореи или олигоменореи у женщин, исследование гипогонадизм у мужчин, подтверждение беременности и некоторые аспекты исследования фертильности.Измерение уровня гормонов у женщин при типичных симптомах менопаузы в этом обычно нет необходимости. В таблице 1 приведены рекомендуемые гормоны. тесты для некоторых из наиболее распространенных клинических сценариев, связанных с эндокринной системой, которые встречаются в общей практике.

От врачей общей практики не ожидается, что они будут исследовать и диагностировать каждую эндокринную дисфункцию. Роль генерала Практикующий часто определяет пациентов, которым требуется направление для дальнейшей оценки и диагностики во вторичном отделении. забота.

Таблица 1: Рекомендуемые гормональные тесты в условиях общей практики

Ключ: = рекомендуется = может потребоваться — = обычно не требуется


Исследование первичной аменореи (задержки полового созревания)

Возможный сценарий: матери приводят своих дочерей на консультацию, поскольку они обеспокоены тем, что у них «месячные» еще не начались, а у других девочек из их группы сверстников уже начались менструации.

В большинстве случаев все, что требуется — это уверенность и бдительное ожидание. Однако, если нет признаков развития груди (первый явный признак полового созревания у девочек) к возрасту 12-14 лет или менструация не началась к 16 годам у женщин с нормальным пубертатным развитием необходимо начать исследование. 9

Частой причиной первичной аменореи является потеря веса, соблюдение диеты или чрезмерные физические нагрузки (известная как гипоталамическая аменорея).Более редкие причины включают заболевание гипофиза или щитовидной железы, анатомические аномалии (например, агенез Мюллера) и врожденные аномалии. (например, синдром Тернера, синдром Каллмана).

Лабораторные исследования могут быть рассмотрены, если опасения не исчезнут, несмотря на период бдительного ожидания. Соответствующие тесты включают: ФСГ, ЛГ, эстрадиол, пролактин, тестостерон, ТТГ и FT4. Может быть трудно интерпретировать значение аномальных результатов, поэтому консультация или направление к эндокринологу или гинекологу для дальнейшего исследования и рекомендуется диагностика.

Уровни эстрадиола могут указывать на то, нет ли абсолютно никаких доказательств активности эстрогена в яичниках или же уровни начали повышаться с допубертатного уровня, что указывает на то, что активность гонад может начаться. Низкий уровень эстрадиола в ассоциации с низким уровнем ЛГ указывает на гипоталамическую аменорею.

Низкий уровень ФСГ и ЛГ (20 МЕ / л) и ЛГ (> 40 МЕ / л) предполагает гипергонадотропный гипогонадизм, что может указывать на синдром Тернера. 10

Повышенный уровень пролактина и / или отклонения от нормы ТТГ и FT4 могут указывать на гипофизарную причину.

Синдром поликистозных яичников, который чаще ассоциируется со вторичной аменореей, иногда может быть причиной первичная аменорея. Об этом может свидетельствовать повышенный уровень тестостерона.

Нормальный уровень гормонов у женщин с первичной аменореей, но в остальном нормальное развитие, может указывать на анатомические аномалии, такие как неперфорированная девственная плева или мюллерова агенезия (врожденный порок, который приводит к отсутствию матки и маточные трубы).При подозрении на это требуется дальнейшее расследование.

Преждевременное половое созревание

Преждевременное (раннее) половое созревание обычно определяется как появление вторичных половых признаков у девочек в возрасте до восьми лет или у мальчиков до девяти лет. Это гораздо более редкое проявление, чем задержка полового созревания и обследование. преждевременного полового созревания у детей сложно. Любой ребенок с ранними признаками вторичных половых признаков должен быть направлен к детскому эндокринологу или педиатру.Своевременное лечение важно, так как преждевременные результаты полового созревания при ускоренном развитии скелета и нарушении окончательного роста взрослой особи.

Исследование вторичной аменореи и олигоменореи

Вторичная аменорея (прекращение менструации у женщин, у которых ранее была менструация) или олигоменорея (менструация постоянно> 35 дней) чаще всего вызывается гипоталамической аменореей, синдромом поликистозных яичников или преждевременным возникновением яичников. неудача (после первого исключения беременности).

Первоначальные исследования включают ФСГ, ЛГ и эстрадиол. Другие тесты будут зависеть от предполагаемой причины. Добавьте пролактин и ТТГ при подозрении на гиперпролактинемию — это может быть связано с галактореей или симптомами заболевания щитовидной железы.

Уровень ФСГ в сыворотке> 20 МЕ / л и низкий эстрадиол у женщин в возрасте

Низкий уровень ЛГ и эстрадиола предполагает гипоталамическую причину аменореи (например, потеря веса, чрезмерные физические нагрузки или стресс).

Гиперпролактинемия

Стресс, прием лекарств и гипотиреоз следует рассматривать как причины гиперпролактинемии.Макропролактин, неактивный форма пролактина, может быть доброкачественной причиной повышения уровня пролактина — это может быть обнаружено с помощью лабораторного анализа. Один раз другие возможные причины повышения пролактина были исключены, визуализация гипофиза (МРТ или КТ) для пролактиномы может рассматриваться во вторичной медицинской помощи.

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ)

СПКЯ можно диагностировать на основании двух из трех следующих критериев: клинических признаков или биохимических признаков гиперандрогении, олигоменорея и / или ановуляция и поликистоз яичников на УЗИ. 11 В большинстве областей, финансируется государством УЗИ для исследования СПКЯ не является приоритетом.

Тестостерон не обязательно требуется для диагностики СПКЯ, и уровни повышаются не у всех женщин с СПКЯ, особенно с минимальными клиническими проявлениями. Можно рассмотреть возможность тестирования тестостерона вместе с ФСГ и ЛГ. у пациентов с умеренным гирсуитизмом, поскольку значительно повышенный уровень может указывать на необходимость рассмотрения других причин.Если общий уровень тестостерона> 5 нмоль / л, необходимо дальнейшее исследование, чтобы исключить другие причины, такие как позднее начало врожденная гиперплазия надпочечников, синдром Кушинга, опухоль надпочечников или яичников. 1 При подозрении на заболевание гипофиза, добавьте пролактин, ТТГ и FT4, чтобы исключить возможность вторичного гипотиреоза.

Уровни свободного тестостерона (рассчитанные из общего тестостерона + SHBG) также иногда измеряются у женщин с СПКЯ, но обычно в этом нет необходимости в условиях общей практики.Рекомендуется проконсультироваться с химическим патологом. или эндокринолог, прежде чем обращаться в ГСПГ.

Уровень

ЛГ обычно повышен, в то время как уровень ФСГ в норме или снижен у женщин с СПКЯ.

Для получения дополнительной информации см .: «Понимание синдром поликистозных яичников », BPJ 12 (апрель 2008 г.).

Исследование менопаузы

Тесты на гормоны обычно не нужны для диагностики менопаузы или мониторинга лечения.

У женщин старше 45 лет с типичными симптомами менопаузы гормоны обычно не рекомендуются, так как уровни имеют тенденцию к значительным колебаниям в течение этого периода, и вероятность наступления менопаузы выше в этой возрастной группе.Возраст и Для постановки диагноза обычно достаточно одного года истории аменореи.

Тестирование ФСГ может быть полезным при определенных обстоятельствах, например, для определения причины олигоменореи и фертильности. потенциал у более молодой женщины (в возрасте 12 лет ФСГ должен обычно повторяется не реже одного раза (например, через шесть недель) для подтверждения результата. 2 N.B. ФСГ не позволяет надежно прогнозировать климакс у женщин, использующих комбинированные пероральные контрацептивы. 2

Нет никакой пользы в измерении уровней эстрадиола для оценки доз заместительной гормональной терапии. 12 Эстрадиол измерение также бесполезно при оценке риска перелома в постменопаузе.

Для получения дополнительной информации см .: «Гормональный заместительная терапия: последние данные и рекомендации по лечению », BPJ 12 (апрель 2008 г.).

Исследование гипогонадизма у мужчин

Задержка полового созревания

Первым признаком полового созревания у мужчин является увеличение размера яичек, что обычно происходит в возрасте около 12 лет. Наиболее частой причиной задержки полового созревания у мужчин является конституциональная задержка роста и полового созревания.Это чаще встречается в мальчики с семейным анамнезом задержки полового созревания. Догоняющий рост, начало полового созревания и всплеск полового созревания происходят позже чем в среднем, но в конечном итоге приводит к нормальному взрослому росту, половому развитию и фертильности.

Если клинические признаки полового созревания отсутствуют примерно к 16 годам, клиническое обследование и обследование могут быть на рассмотрении. Первоначальные лабораторные исследования включают ФСГ, ЛГ, тестостерон, пролактин, ТТГ и FT4.Рекомендуется что результаты обсуждаются с эндокринологом, и пациент направляется для дальнейшего обследования и диагностики если необходимо.

Повышенный уровень ФСГ и ЛГ указывает на первичный гипогонадизм. Низкие или нормальные уровни ФСГ и ЛГ предполагают вторичный гипогонадизм, который в редких случаях может быть связано с дисфункцией гипоталамуса, гипопитуитаризмом, гипотиреозом или гиперпролактинемией. Конституционный задержка полового созревания связана с низким уровнем ФСГ и ЛГ.

Для получения дополнительной информации см .: «Выбранные темы мужского здоровья », Best Tests (сентябрь 2010 г.).

Гинекомастия

Гинекомастия — доброкачественное увеличение ткани груди у мужчин, которое указывает на дисбаланс между свободными эстрогенами. и андрогены. Важно различать настоящую гинекомастию, которая ощущается как концентрический, эластичный или твердый бугорок. ткани вокруг соска из-за скопления жировой ткани.

Гинекомастия довольно часто встречается в период среднего и позднего полового созревания, когда относительно высокие уровни эстрогена производятся яички и периферические ткани, прежде чем тестостерон достигнет уровня взрослого.Почти во всех случаях это разрешается в от одного до двух лет. Заболеваемость гинекомастией снова возрастает у пожилых мужчин, что, возможно, связано со снижением уровня свободного тестостерона. уровни.

У взрослых мужчин с гинекомастией после устранения причин, таких как лекарства (например, антиандрогены, трициклические антидепрессанты, метронидазол, спиронолактон, блокаторы кальциевых каналов, циметидин) или сопутствующее заболевание (например, цирроз), рассмотрите возможность тестирования уровня тестостерона (а затем — ЛГ, если он низкий), эстрадиола и ХГЧ.ХГЧ измеряется, потому что в редких случаях Производство ХГЧ опухолью яичка (или другой эктопической опухолью, секретирующей ХГЧ), может привести к чрезмерному уровню эстрогена, проявляется как увеличение ткани груди.

Для получения дополнительной информации см .: «Выбранные темы мужского здоровья », Best Tests (сентябрь 2010 г.).

Поздний гипогонадизм

У взрослого мужчины с клинически значимыми признаками и симптомами гипогонадизма (например, снижение либидо, отсутствие ранним утром эрекция), подумайте о тестировании уровня тестостерона.Образец следует собирать рано утром, например 8 утра, как дневные и вечерние уровни могут быть значительно ниже.

Если единичный уровень тестостерона ранним утром явно находится в пределах нормы (например,> 15 нмоль / л), то больше не нужно требуется тестирование. Если обнаружен низкий или пограничный уровень тестостерона, необходимо провести подтверждающий тест рано утром. (когда пациент здоров) и одновременное измерение ЛГ, чтобы отличить возможные первичные от вторичных гипогонадизм.Если уровни ЛГ низкие, можно добавить пролактин для исследования гиперпролактинемии.13 Требуется только ФСГ. добавлено при исследовании фертильности.

Высокий уровень ЛГ в сыворотке (и ФСГ, если измеряется) и низкий или пограничный уровень тестостерона соответствуют первичному гипогонадизму. Низкий или несоответствующий нормальный уровень ЛГ в сочетании с низким уровнем тестостерона соответствует вторичному гипогонадизму.

SHBG, для измерения свободного тестостерона, требуется только в редких случаях, например, при нарушениях связывания половых гормонов. (е.грамм. гипертиреоз, прием противосудорожных средств, тяжелое ожирение) могут ввести в заблуждение уровень общего тестостерона. Обсуждение в таких случаях может помочь эндокринолог или химический патолог

Для получения дополнительной информации см .: «Возрастные снижение тестостерона у мужчин », Best Tests (июнь 2012 г.).

Исследование недостаточной фертильности

Вероятность того, что здоровая пара репродуктивного возраста забеременеет в каждом репродуктивном цикле, составляет 20-25%. 14 Это возрастает до 60% в течение шести месяцев, 84% в первый год и 92% в течение второго года. 14

Если у пары возникают проблемы с фертильностью, сначала успокойте и дайте совет относительно фертильной фазы менструального цикла. цикл и оптимальная частота полового акта, то есть каждые два-три дня. Графики температуры бесполезны и должны не рекомендуется. 15 Факторы образа жизни, влияющие на фертильность, такие как ИМТ 30 и курение, должны быть адресованным.

Расследование может быть рассмотрено, если беременность не наступила через 12 месяцев у женщины в возрасте 35 лет. 15 Оба партнера должны быть оценены и обследованы. Первоначальные расследования В первичной медико-санитарной помощи необходимо установить, идет ли овуляция у самки и есть ли у мужчины нормальный анализ спермы. 15

У женщины с регулярным менструальным циклом можно предположить, что происходит овуляция. Однако, если есть сомнения (т.е.беременность не наступила в ожидаемые сроки) прогестерон можно измерить за семь дней до ожидаемого срока. дата менструации, например на 21 день обычного 28-дневного цикла, чтобы проверить, произошла ли овуляция — овуляция вероятна если прогестерон> 25 нмоль / л. У женщин с длительным циклом прогестерон можно проверить на 21 день цикла, а затем повторять каждые семь дней до наступления менструации (или всего за семь дней до предполагаемой менструации, если циклы продолжительны. но штатный).

ФСГ, ЛГ и эстрадиол следует проверять в начале менструального цикла (второй — шестой день, где первый день — первый день). менструации). 15 Повышенный уровень ФСГ свидетельствует о снижении резерва яичников и вероятности преждевременных родов. яичниковая недостаточность. 15

Самок с отсутствующими или нерегулярными циклами следует обследовать на предмет вторичной аменореи.

Если у партнера-мужчины изначально был ненормальный анализ спермы, повторите его через шесть недель для подтверждения.Дальнейшее расследование Анализ основных причин аномального анализа спермы обычно проводится в отделении вторичной медико-санитарной помощи. Однако тестостерон, ФСГ и ЛГ могут быть исследованы при подозрении на гипогонадизм.

Критерии оценки субфертильности у женщин, финансируемой государством, следующие:

  • ИМТ 18-32
  • Некурящий или бывший курильщик> трех месяцев
  • Возраст
  • Менее двух детей от текущих отношений
  • Не менее двух лет субфертильности,

или

один год, если возраст 35 или шесть месяцев, с ановуляцией, азооспермией, олигоспермией, двусторонней салингэктомией, непроходимостью маточных труб, офрэктомия или преждевременная недостаточность яичников

Устойчивость к андрогенам

Измерение эстрадиола рекомендуется мужчинам с обнаружением высоких уровней сывороточного тестостерона и ЛГ, а также особенности недостаточной маскулинизации (напр.грамм. редкие волосы на лобке, лице или теле, недоразвитая мошонка, половой член и яички), как это наводит на мысль об устойчивости к андрогенам. 13

Раннее направление к репродуктологу или соответствующему специалисту следует предложить, если: 16

  • Возраст партнера старше 35 лет
  • У партнерши аменорея / олигоменорея
  • Партнерша в анамнезе перенесла операции на органах брюшной полости или таза
  • Партнерша прошла патологическое обследование органов малого таза
  • У партнера женского или мужского пола в анамнезе были инфекции, передающиеся половым путем (включая воспалительные заболевания органов малого таза)
  • У партнера-мужчины ненормальный анализ спермы
  • У партнера-мужчины неопустившиеся яички или другая патология половых органов
  • Партнер-мужчина в анамнезе урогенитальный хирург
  • У партнера-мужчины варикоцеле
  • Пара очень обеспокоена и будет уверена, если проконсультируется.

Отдельные клиники репродуктивного здоровья могут иметь особые критерии для направления к специалистам, обратитесь за советом в местную клинику.

Исследование беременности на ранних сроках

Случайный анализ мочи на ХГЧ может использоваться в первичной медико-санитарной помощи для диагностики беременности на ранних сроках. Положительный анализ мочи возможен на однако в первый день задержки менструации откладывание теста снижает вероятность ложноотрицательного результата. Ложноотрицательный результат может возникнуть, если анализ мочи будет проведен слишком рано после имплантации эмбриона, особенно если образец мочи разбавлен. Если есть подозрение на беременность, несмотря на отрицательный результат теста, тест следует повторить через неделю.В зависимости от в зависимости от типа используемого набора, уровни ХГЧ> 20–25 МЕ / л покажут положительный результат. Большинство производителей домашних тестов на беременность имеют аналогичный порог обнаружения и считаются надежными при использовании в соответствии с инструкциями производителя. 17 А положительный или отрицательный результат домашнего теста на беременность обычно должен быть подтвержден врачом, чтобы убедиться, что техника отбора проб была соблюдена.

Женщинам репродуктивного возраста с болями в нижней части живота следует предложить анализ мочи на ХГЧ, чтобы исключить возможность беременности.

Тест на ХГЧ в сыворотке может обнаружить ХГЧ на более низких уровнях, чем анализ мочи для подтверждения беременности, однако в этом нет необходимости. запросите это, если есть положительный анализ мочи на ХГЧ. Не рекомендуется использовать серийные тесты на ХГЧ в общих Практика, обеспечивающая нормальное течение беременности, так как это может вызвать ненужное беспокойство у пациентки. Если есть какие-либо клинические опасения по поводу жизнеспособности беременности, пациентку следует направить на раннюю беременность. поликлиника или гинекологическое отделение для дообследования и УЗИ.Распространенные причины боли внизу живота или вагинальной Прежде всего следует исключить кровотечение, такое как инфекция мочевыводящих путей или запор.

Модель фармакокинетики и физиологической обратной связи между гормонами оси яичко-гипофиз у взрослых самцов крыс: основа для оценки эффектов эндокринно-активных соединений

Abstract

Ось яичко-гипоталам-гипофиз контролирует репродуктивные функции у самцов. Было разработано описание основных физиологических взаимодействий у взрослых крыс между тестостероном, лютеинизирующим гормоном (ЛГ) и фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), что позволяет моделировать уровни гормонов в семенниках и крови.Эта модель была использована для моделирования уровней гормонов у интактных, кастрированных, обработанных этандиметансульфонатом и антиандрогенов крыс. Большой градиент концентраций тестостерона от интерстициальной жидкости яичек до низких уровней в периферической крови создается кровотоком в яичках. Доминирующая петля обратной связи — это положительная регуляция синтеза тестостерона ЛГ и отрицательная обратная связь тестостерона на ЛГ и ФСГ. Полезность модели для размещения данных in vitro в контексте физиологии in vivo была проиллюстрирована для случая непрерывного синтеза тестостерона изолированными семенниками.В отсутствие кровотока очень низкий остаточный синтез тестостерона может значительно увеличить концентрацию тестостерона в изолированных семенниках. Эффекты экзогенного эндокринного активного соединения были проиллюстрированы путем моделирования измененной регуляции ЛГ и ФСГ тестостероном в присутствии антиандрогена, действующего как конкурентный лиганд для рецептора андрогена. Повышение концентрации не влияет на устойчивый уровень гормона до тех пор, пока не будет достигнут достаточный уровень антиандрогена, чтобы уменьшить отрицательную обратную связь тестостерона на ЛГ и ФСГ.Таким образом, была разработана модель, которая обеспечивает основу для инициирования оценок ключевых вопросов, вызывающих озабоченность при оценке риска эндокринно-активных соединений, включая экстраполяцию in vitro, in vivo, и их дозозависимое поведение.

Ключевые слова

Фармакокинетика тестостерона

Нарушение эндокринной системы

Активные эндокринные соединения

Фармакокинетическая модель

Тестостерон

антиандрогены

регулирование обратной связи

Рекомендуемые статьи

Общество по токсикологии (полный текст)Опубликовано Elsevier Inc. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Пример различных гликоформ ФСГ с помощью моделирования молекулярной динамики

Abstract

Гонадотропин, известный как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), играет ключевую роль в регуляции репродуктивных процессов. Физиологически активный ФСГ представляет собой гликопротеин, который может размещать гликаны на четырех остатках аспарагина, включая два сайта в субъединице ФСГ, которые имеют решающее значение для биохимической функции, плюс два сайта в субъединице β, чьи состояния дифференциального гликозилирования соответствуют физиологически различным функциям .Некоторая степень гипогликозилирования FSHβ, по-видимому, дает преимущества в отношении репродуктивной фертильности репродуктивных женщин. Чтобы определить возможные механистические основы этого физиологического различия, мы провели интенсивное в вычислительном отношении молекулярно-динамическое моделирование комплексов между высокоаффинным сайтом гонадного рецептора ФСГ (ФСГ) и несколькими гликоформами ФСГ, включая полностью гликозилированные (ФСГ 24 ), гипогликозилированные. -гликозилированный (например, FSH 15 ) и полностью дегликозилированный FSH (dgFSH).Это моделирование предполагает, что отклонения в профиле связывания FSH / FSHR в зависимости от состояния гликозилирования являются умеренными, когда FSH украшен только небольшими гликанами, такими как отдельные остатки N-ацетилглюкозамина. Однако существенные качественные различия возникают между FSH 15 и FSH 24 , когда FSH украшен гораздо более крупным тетраантенным гликаном. В частности, комплекс FSHR с гипогликозилированным FSH 15 подвергается значительному конформационному сдвигу после 5-10 нс моделирования, что указывает на то, что FSH 15 имеет большую конформационную гибкость, чем FSH 24 , что может объяснить более благоприятные FSH 15 кинетический профиль.FSH 15 также демонстрирует более сильную свободную энергию связи, в значительной степени из-за образования более тесных и устойчивых солевых мостиков с FSHR.

Образец цитирования: Мехер Б.Р., Диксит А., Боусфилд Г.Р., Лашингтон Г.Х. (2015) Влияние гликозилирования на динамику взаимодействия ФСГ-ФСГР: тематическое исследование различных гликоформ ФСГ с помощью моделирования молекулярной динамики. PLoS ONE 10 (9): e0137897. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897

Редактор: Штефан Шлатт, Университетская клиника Мюнстера, ГЕРМАНИЯ

Поступила: 2 апреля 2015 г .; Принята к печати: 23 августа 2015 г .; Опубликовано: 24 сентября 2015 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, изменять, строить или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0, выделенная в общественное достояние

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе.

Финансирование: Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения, грант P01 AG-029531, предоставленный GRB. LiS Consulting оказывала поддержку в виде заработной платы GHL, но не играла никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.Конкретная роль этого автора сформулирована в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: У авторов есть следующие интересы. Джеральд Х. Лашингтон работает в LiS Consulting. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Введение

Значительная часть функционального разнообразия белков происходит из их состояний гликозилирования: посттрансляционных модификаций, которые широко наблюдаются в протеоме в качестве механизма, способствующего правильной укладке одних белков и термодинамической стабилизации других.Помимо конформационной стабилизации, вариации в состояниях гликозилирования обеспечивают механизм для контроля участия белков в широком спектре различных биохимических процессов, играя особенно важную роль в посредничестве молекулярных взаимодействий между клетками и их средой [1]. Из-за этих ролей неудивительно обнаружить, что состояния гликозилирования определенных белков стали рассматриваться как источники фенотипически чувствительных биомаркеров для разнообразного диапазона состояний здоровья [2].Однако в большинстве случаев точные кинетические и термодинамические механизмы, с помощью которых гликозилирование определяет свое биохимическое влияние, плохо изучены [3].

Одним из конкретных клеточных взаимодействий, функция и эффективность которого, как известно, зависит от состояния гликозилирования, является ассоциация фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с его клеточным рецептором (ФСГР). ФСГ — гонадотропный гормон, ответственный за передачу гормональных сигналов в половых железах. Гетеродимерный по форме, ФСГ имеет высокогомологичную альфа-субъединицу из 92–96 аминокислотных остатков с другими гликопротеиновыми гормонами, такими как лютеинизирующий гормон (ЛГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и хорионический гонадотропин (ХГ).Каждый из этих гормонов проявляет отличную биохимическую функцию благодаря их индивидуальным бета-субъединицам и их различным профилям гликозилирования. В случае ФСГ гетеродимер может подвергаться гликозилированию по четырем различным остаткам аспарагина: положениям 52 и 78 последовательности ФСГ и положениям 7 и 24 ФСГβ. На рис. 1 показана топология и относительная ориентация гликозилированного ФСГ в комплексе со своим рецептором. ФСХР. Критическая роль состояния гликозилирования ФСГ в стимулировании активации ФСГ известна в течение некоторого времени [4-6], но недавнее открытие вариаций в состоянии гликозилирования человеческого ФСГβ, для которых были идентифицированы гипогликозилированные варианты [7, 8] выдвинул гипотезу о том, что разные изоформы вызывают ключевые различия в репродуктивной функции [9] и, в частности, способствуют снижению женской фертильности в зависимости от возраста [9].Поскольку появились методы лечения бесплодия, которые включают стимуляцию ФСГ с помощью мочевых или рекомбинантных препаратов ФСГ (например, [10]), стало особенно важно охарактеризовать зависимость фертильности от конкретных состояний гликозилирования, чтобы потенциально оптимизировать условия для оплодотворения. Другая проблема со здоровьем, фенотипическая характеристика которой может также иметь отношение к состоянию гликозилирования ФСГ, — это ускорение остеопороза в постменопаузе [11].

Рис. 1. Четвертичные и первичные структуры FSH / FSHR, исследованные в этом исследовании.

( и ). Структура, показывающая комплекс FSH-FSHR с частичным гликозилированием NAG (N-ацетилглюкозамин). Ленты, окрашенные в зеленый и голубой цвета, идентифицируют субъединицы FSHα и FSHβ соответственно. Первый гликозилирован NAG в положениях 52 и 78 последовательности, тогда как последний гликозилирован в положениях 7 и 24. NAG показаны в виде моделей палочек серого цвета. Розовая лента показывает часть внеклеточного домена рецептора ФСГ, которая обладает высокоаффинным сайтом связывания ФСГ.( б ). Аминокислотные последовательности остатков FSHα 3–92 (желтый), FSHβ 3–107 (зеленый) и FSHR 1–241 (коричневый) показаны ниже. На последующих рисунках цветная полоса будет обозначать каждый белок, а программа нумерует остатки 1–437.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g001

Данные свидетельствуют о том, что полное гликозилирование ФСГα постоянно требуется для нормальных биологических функций [5,6], но есть признаки того, что ФСГβ проявляет биологическую функциональность (хотя и с разными эффективность по отношению к различным клеточным мишеням) при гликозилировании по одному или обоим сайтам N-гликозилирования FSHβ [7,12,13].Для целей данного исследования номенклатура изоформ относится к приблизительной молекулярной массе ФСГβ, определенной в Вестерн-блоттинге, которую (с учетом вариаций для конкретного гликанового состава) можно резюмировать следующим образом: ФСГ 24 относится к полностью гликозилированному ФСГ (т. Е. Гетеродимеру). с гликанами на обоих остатках аспарагина ФСГβ; молекулярная масса приблизительно 24 кДа), ФСГ 15 для полностью гипогликозилированного ФСГβ без замен на аспарагин (молекулярная масса ≈ 15 кДа) и ФСГ 21 для гипогликозилированного ФСГβ с заменой при только Asn7 (MW ≈ 21 кДа) и FSH 18 для гипогликозилированного FSH с заменой только на Asn24 (MW ≈ 18 кДа).Субъединица FSHα всегда содержит как N-гликаны, так и мигрирует в виде единой полосы после SDS-PAGE, хотя и с различной подвижностью в зависимости от прикрепленных популяций гликанов. Эти варианты гликоформы ФСГ приведены на рис. 2. Состав и структура тетраантенного гликана, использованного в моделировании, показаны в схематической форме на рис. 3 с использованием системы Оксфордского института гликобиологии [14,15], с одной модификацией для того, чтобы обеспечивают читателям лучшее понимание структуры — линия связи α / β 1–6 стала длиннее, что указывает на экзоциклический атом углерода.Все другие связи включают кольцевые атомы углерода.

Рис. 2. Гликоформы ФСГ возникают в результате частичного гликозилирования субъединицы чФСГβ.

Варианты определяются по молекулярной массе субъединицы FSHβ на основе экспериментов вестерн-блоттинга. Первичные структуры обозначены сплошными линиями, 92 остатка для FSHα и 111 для FSHβ. Камертоны представляют собой N-гликаны, если они присутствуют. N — это однобуквенный код аспарагина, а верхний индекс представляет положение каждого остатка в первичной структуре.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g002

Рис. 3. Схематическая диаграмма тетраантенного гликана, используемого в моделировании.

Линия связи α / β 1–6 длиннее, что указывает на экзоциклический атом углерода. Все другие связи включают кольцевые атомы углерода.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g003

В то время как ФСГ 24 , по-видимому, преобладает у мужчин и женщин в постменопаузе, ФСГ 21 демонстрирует повышенное изобилие у молодых женщин с нормальным деторождением. возраст, что привело к предположению, что гипогликозилирование ФСГ может играть преимущественную роль в эффективной стимуляции развития фолликулов яичников и, таким образом, служить регулятором репродуктивной фертильности [13].Интересно, что кристаллографические данные ясно указывают на то, что ассоциация FSH / FSHR продуцирует комплекс, который в первую очередь ориентирует гликаны FSHβ от рецептора [16,17]. Таким образом, любая усиленная биохимическая передача сигналов, осуществляемая гипогликозилированной изоформой, вероятно, связана не с облегчением стерического конфликта гликанов / рецепторов, а, скорее, связана либо с изменением конформации ФСГ (чтобы сделать его более термодинамически подходящим для связывания ФСГР). или гибкость ФСГ (чтобы сделать лиганд более кинетически легким для связывания).Относительные перспективы для любого сценария могут быть переданы кинетическими наблюдениями: относительно быстрая ассоциация ФСГ / ФСГ, сопровождаемая аналогичным сложным персистентным поведением, будет иметь тенденцию предполагать кинетически ограниченный механизм (то есть, более вероятно, управляемый повышенной гибкостью гипогликозилированного ФСГ), в то время как подобная ассоциативная кинетика, сопровождаемая значительным расхождением в стойкости комплекса, больше отражает термодинамические факторы. Предварительные кинетические данные предполагают существенное различие в кинетике, связанной с началом комплексообразования ФСГ / ФСГР [18].

Идеальной основой для попытки понять гликоформную зависимость кинетики FSH / FHSR и ассоциативных термодинамически регулируемых процессов является структурно-биологическая характеристика конкретных участников этих процессов; в частности, гликоформы ФСГ и различные другие белки, с которыми они могут взаимодействовать значимым образом. К сожалению, структурная характеристика ФСГ оказалась сложной задачей; На момент завершения этого исследования в нашем распоряжении были две релевантные кристаллические структуры (гетеродимера ФСГ только [19] и в комплексе с участком сайта связывания ФСГР [16]; комплекс со всем внеклеточным доменом ФСГР, имеющим сообщалось совсем недавно [20]).Практические проблемы, с которыми пришлось столкнуться при получении этих структур, сделали маловероятным, что кристаллографический протокол с высокой пропускной способностью будет использоваться с целью разрешения потенциально значительного числа различных гликоформ, соответствующих дифференциальному замещению в субъединице и популяции β множеством различных гликанов в четыре сайта гликозилирования на гетеродимере ФСГ. Более практичным решением было бы применить существующие структурные знания о ФСГ и его рецепторном комплексе к моделированию молекулярной динамики (МД) соответствующих гликоформ, таким образом достигнув довольно строгой оценки структурных, энергетических и кинетических зависимостей, возникающих из различного состояния гликозилирования.Работа, представленная в настоящем документе, предназначена для использования в качестве доказательства принципа исследования с конкретной целью использования моделирования для проверки того, связана ли лучшая кинетика связывания гипогликозилированного ФСГ с большей структурной гибкостью ФСГ, большей свободной энергией связывания ФСГ, или, возможно, оба. Исследование также предназначено как средство для создания основы для деконволюции ассоциативного механизма и, таким образом, потенциально предоставляет средство для разработки гликоформ FSH со специализированными атрибутами связывания FSHR.С этой целью мы провели моделирование МД, которое противопоставляет поведение гипогликозилированного ФСГ (ФСГ 15 ) по сравнению с ФСГ 24 посредством украшения двумя разными модельными гликанами. Эти два гликана включают один из самых маленьких (единственный остаток N-ацетилглюкозамина (NAG), который отражает химически [4] и эндогликозидазу F [16], [17] дегликозилированный ФСГ) и один из самых больших (тетраантенный гликан ( TAG)), имеющего отношение к исследованиям ФСГ. Для обеих гликановых моделей моделировали гликозилирование по двум или четырем сайтам ФСГ.В дополнение к моделированию ФСГ 15 и ФСГ 24 с различными гликанами было изучено динамическое поведение полностью дегликозилированного ФСГ (который мы будем называть dgFSH). Во всех этих случаях поведение FSH было исследовано в комплексе с той частью рецептора FSHR, кристаллографически разрешенной Fan и Hendrickson [16], поскольку эти исследования предшествовали более поздней структуре, описанной Jiang et al . [17].

Материалы и методы

2.1 Системные настройки

Кристаллическая структура комплекса FSH-FSHR (код PDB 1XWD; разрешение 2,92 Å) [16] с однодоменной конформацией была использована в качестве стартовой структуры для моделирования MD. В общей сложности для этого исследования было выполнено пять различных имитаций, с указанием следующих ссылок в зависимости от состояния гликозилирования и конкретной присоединенной модели гликана: ( 1 ) dgFSH / FSHR; ( 2 ) FSH 15 (NAG) / FSHR; ( 3 ) FSH 24 (NAG) / FSHR; ( 4 ) FSH 15 (TAG) / FSHR; и ( 5 ) FSH 24 (TAG) / FSHR.

Поскольку кристаллическая структура заполнена гликанами NAG по всем четырем остаткам аспарагина, полученным в результате обработки эндогликозидазой F (структура 3 выше), мы использовали это как модель FSH 24 (NAG), а затем построили предварительные структуры для дегликозилированных и гипогликозилированных -гликозилированные белки NAG (структуры 1, 2 выше) путем удаления соответствующих остатков гликана вручную с помощью SYBYL [21]. Модель гликана TAG была построена с использованием веб-программы Carbohydrate Builder, предоставленной Dr.Р.Дж. Woods, University of Georgia [22], и был включен в структуру FSH с помощью SYBYL. Модуль tleap программного обеспечения AMBER10 [23] использовался для протонирования каждого из комплексов белок-лиганд и для подготовки связанных файлов топологии и координат, с указанием параметров силового поля ff99SB [24] для белков и параметров силового поля Glycam06 [ 25] для гликанов. Система была сольватирована с моделями воды TIP4P [26,27] в периодическом ящике размером 89,2 x 84,8 x 96,3 Å 3 , содержащем более 17 000 молекул воды.Ящики для явной водной сольватации были сконструированы для каждого комплекса с буферным расстоянием 10 Å; предполагая нормальные зарядовые состояния ионизируемых групп, соответствующие pH = 7,0, ионы натрия (Na + ) были добавлены для достижения нейтральности заряда способом, имитирующим биологическую среду.

Для этого исследования мы реализовали строгий и систематический протокол для устранения неоптимальных атомных контактов, возникающих в результате автоматизированного протонирования, сольватации и нейтрализации заряда. Это повлекло за собой как молекулярную механику, так и уточнение МД благодаря NAMD, высоко масштабируемому программному обеспечению для моделирования [28].NAMD подходит для эффективного параллельного моделирования, выполняемого на большом количестве вычислительных узлов; Большинство наших симуляций в настоящем исследовании выполнялись для 32 процессорных ядер.

Первый шаг в нашем протоколе структурного уточнения включал начальную минимизацию молекулярной механики на 20000 шагов, сохраняя фиксированный белковый каркас, с последующими 20000 шагами минимизации без ограничений (т. Е. Полностью свободной релаксации). Анализ распределения атомных сил на результирующей структуре предположил эффективное удаление нефизических контактов, которые в противном случае могли бы передать нереалистичные силы в последующие модели МД.

Для различных этапов МД, участвующих в уточнении структуры и в последующем аналитическом моделировании, использовался временной шаг интегрирования 2,0 фс. Несвязанные ван-дер-ваальсовы взаимодействия были смоделированы с использованием функции переключения на 10 Å и простирающейся на расстояние 12 Å. Алгоритм Эвальда с сеткой частиц, PME [29], реализованный в NAMD, использовался для обработки электростатических сил дальнего действия. Для ранних этапов, на которых химические связи с атомами водорода фиксировались на их равновесных ковалентных расстояниях, применялся алгоритм SHAKE [30], тогда как ограничения тяжелых атомов были затронуты с помощью протокола SETTLE [31].

2.2 Моделирование молекулярной динамики

Каждый комплекс был адаптирован для МД моделирования путем постепенного нагрева с последующим изобарическим уравновешиванием. В частности, температура системы постепенно увеличивалась с шагом 20K до достижения температуры моделирования 300K, выполняя 15000 шагов моделирования (30 пс) для уравновешивания при каждом приращении температуры, с фиксированным расстоянием водородной ковалентной связи и с применением умеренного ограничения в 10 ккал. моль -1 Å -2 по α-углеродам аминокислоты (C α ), чтобы сохранить основные складки белка.После этого системе было разрешено дальнейшее уравновешивание 150 000 шагов (300ps) при 310K (постоянный объем), а затем 150 000 шагов (300ps) при 310K при постоянном давлении с использованием поршня Ланжевена для достижения относительно стабильного размера ячейки. Затем все ограничения были сняты, поскольку каждая система была уравновешена для 500 000 шагов (1 нс) при постоянном объеме и 500 000 шагов (1 нс) при постоянном давлении. Наконец, моделирование постоянного давления было выполнено для каждой системы, работающей на уравновешенной конструкции в течение 40 нс при давлении 1 бар и температуре 310 К.

В целях характеристики аналитические траектории для каждой системы были опрошены, чтобы описать среднеквадратичное кумулятивное отклонение положений атомов основной цепи (RMSD) относительно уравновешенной структуры и среднеквадратичные флуктуации в положениях атомов основной цепи (RMSF). Устойчивость ключевых солевых мостиков, стабилизирующих интерфейс FSH / FSHR, также отслеживалась путем отбора проб после каждых 1000 th временных шагов, NO-расстояния между заряженными атомами в аргинине и лизине (N / катионный) по сравнению с аспартатом и глутаматом (O / анионным). боковые цепи в области интерфейса.

2.3 MM-GBSA Расчеты

Наконец, чтобы количественно оценить относительную свободную энергию связывания FSH / FSHR в каждой системе, структура каждой системы (уравновешенная согласно предыдущему описанию через NAMD) была подвергнута расчетам на основе MM-GBSA (Обобщенная площадь бортовой поверхности молекулярной механики) [ 32], как это реализовано в пакете AMBER10 [23]. Силовое поле и заряды, использованные для этих расчетов, были идентичны указанным для предыдущих симуляций NAMD. Энергии связывания были количественно определены с помощью снимков, собранных с интервалом 1 нс для всего моделирования.Для каждого комплекса было сделано всего 40 снимков. Для всех других параметров, связанных с расчетами MM-GBSA, были оставлены стандартные значения по умолчанию, за исключением того, что изменения в конформационной энтропии считались незначительными (в силу очень скромных профилей RMSD и RMSF, очевидных из более ранних симуляций) и были исключены из рассмотрение.

В целом метод MM-GBSA можно резюмировать следующим образом: (1) где Δ G bind — свободная энергия связи в растворе, состоящая из свободной энергии молекулярной механики (Δ E MM ), свободной энергии сольватации (ΔG sol ) и конформационного энтропийного эффекта за счет связывания (-TΔS).Однако в настоящем исследовании расчеты энтропии были сочтены незначительными и исключены из рассмотрения, как описано выше.

Следовательно, метод расчетов MM-GBSA, использованный в данном исследовании, можно резюмировать следующим образом: (2) Δ E MM можно выразить как: (3) где Δ E vdw и Δ E ele соответствуют ван-дер-ваальсовым и электростатическим взаимодействиям в газовой фазе соответственно. Свободная энергия сольватации (Δ G sol или GBSOL) далее делится на две составляющие: (4) где Δ G pol и Δ G nonpol — полярный и неполярный вклады в свободную энергию сольватации соответственно.Δ G sol вычисляется с помощью модуля PBSA пакета программ AMBER. В нашем расчете диэлектрическая проницаемость для растворенного вещества установлена ​​равной 1,0, а для растворителя — 80,0. Неполярный вклад свободной энергии сольватации рассчитывается как функция доступной для растворителя площади поверхности (SASA) следующим образом: (5) где значения эмпирических констант γ и β были установлены равными 0,00542 ккал / (моль 2 ) и 0,92 ккал / моль соответственно. Графическая визуализация и представление структур белков выполнялись с помощью программы PyMol [www.pymol.org].

Результаты и обсуждения

3.1 Анализ RMSD

Анализ

RMSD для различных комплексов представлен на рис. 4. Во всех случаях структура имеет тенденцию претерпевать незначительный сдвиг (RMSD> 2,0 Å) в течение первых 5 нс моделирования с последующим присоединением к относительно стабильной конформации после этого. Это довольно скромный уровень структурного сдвига, который в первую очередь можно приписать разнице в температуре моделирования (310 K) по сравнению с условиями, при которых обычно выполняется определение характеристик кристалла (обычно менее 100 K в зависимости от точной методики; в этом случае точная температура не указана для исходной кристаллической структуры [13]).Единственный другой значительный стимул для структурной релаксации — это существенная модификация структуры, которая заметно нарушает равновесный баланс сил, присутствующих в кристаллизованной структуре. Поскольку исходная кристаллическая структура гликозилирована по всем четырем релевантным остаткам аспарагина и поскольку кристаллизованный гликан на каждом сайте представляет собой единственный остаток NAG, было бы нормально ожидать отсутствия существенной структурной релаксации моделированной системы FSH 24 (NAG).Таким образом, его можно рассматривать как базовый ориентир для оценки структурной релаксации со стороны других систем. Таким образом, из фиг. 4A мы находим, что ни один из других вариантов NAG-замещенного ФСГ, по-видимому, не релаксирует способом, который качественно сильно отличается от ФСГ 24 (NAG). Более того, введение сбалансированных модификаций, таких как удаление всех четырех гликанов или замена всех четырех остатков NAG на гораздо больший отросток TAG, по-видимому, мало влияет на общую структурную стабильность системы.Однако несбалансированная структура FSH 15 (TAG) ведет себя заметно отличным образом, демонстрируя резкий структурный сдвиг между 5–10 нс в моделировании (рис. 4B).

Рис. 4. Среднеквадратичное отклонение положения корня между положениями атомов основной цепи белка FSH во время моделирования молекулярной динамики, вычисленное относительно исходных рентгеновских кристаллографических координат.

А . Сравнение гликоформ ФСГ, украшенных одиночными остатками NAG. В .Сравнение гликоформ ФСГ, украшенных олигосахаридами ТАГ.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g004

Из рис. 4B можно отметить, что в течение всего 40 нс моделирования общее среднеквадратичное значение FSH 24 (TAG) и dgFSH в конечном итоге достичь уровня, сопоставимого с FSH 15 (TAG), однако распределение позиционного отклонения в FSH 15 (TAG) не эквивалентно FSH 24 (TAG). Как показано на фиг. 5A и 5B, мы обнаружили, что точное состояние гликозилирования оказывает существенное влияние на определение того, какие конкретные остатки демонстрируют наибольшие сдвиги относительно исходной кристаллической структуры.Независимо от состояния гликозилирования, процент остатков, которые демонстрируют сдвиги RMSD основной цепи более чем на 1,5 Å от уравновешенных положений, относительно невелик. Почти все общие вариации, которые наблюдаются в каждой структуре, происходят на поверхности, подверженной воздействию растворителя, и в этом подмножестве преобладающая часть общей вариации локализуется в основном либо в гибких петлях, либо на концах цепи. Относительно немного высокоподвижных остатков обнаруживается в непосредственной близости от интерфейса FSH / FSHR, где они будут иметь наибольшее влияние на кинетику связывания FSH.В случае остатков, расположенных на границе раздела FSH 24 (TAG) / FSHR или рядом с ним, только Lys40 и Ala43 (оба в FSHβ) демонстрируют позиционные сдвиги более 1,5 Å, в то время как для FSH 15 (TAG) / Интерфейс FSHR, указанный в списке, включает Lys40, Ala43, Asp88 и Ser89 в FSHβ плюс Met47, Leu48 и Val49 в FSHα.

Рис. 5. Сравнение динамических структурных особенностей FSH на интерфейсе FSH / FSHR для гликоформ FSH (TAG).

A. FSH 15 (TAG) и B. FSH 24 (TAG).Белковая часть ФСГ представлена ​​в виде ленты, в то время как пространственная протяженность остатков гликана ТАГ показана с помощью прозрачных зеленых элементов. Ленты FSH окрашены следующим образом: синий = остатки FSH с контактными поверхностями FSHR; красный = остатки ФСГ со сдвигом RMSD основной цепи более 1,5 Å; фиолетовый = остатки FSH с контактными поверхностями FSHR и среднеквадратичным сдвигом основной цепи более 1,5 Å.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g005

3.2 Сравнение белков по RMSF

Мы также проанализировали вариации гибкости белка, рассчитанные на основе среднеквадратического отклонения (RMSF) атомов Cα остатков.Для облегчения анализа профили средней гибкости белка были сопоставлены с соответствующими конформационными состояниями только различных гликозилированных и негликозилированных субъединиц ФСГ (dgFSH, FSH 15 и FSH 24 ) и взаимодействующих комплексов FSH-FSHR (dgFSH-FSHR). , FSH 15 -FSHR, FSH 15 (NAG) -FSHR, FSH 15 -FSHR и FSH 24 (TAG) -FSHR) с использованием цветовой скользящей схемы. Цветовая скользящая схема соответствует следующим диапазонам значений гибкости белка: красный (очень гибкий с +5.00 Å), коричневый (значения +4,00 Å), желтый (+3,00 Å), зеленый (+2,00 Å), голубой (+1,00 Å) и синий (наименее гибкий). В соответствии со структурными факторами области больших тепловых флуктуаций и повышенной конформационной гибкости соответствовали петлям β-шпилек обоих мономеров ФСГ, концам как ФСГ, так и ФСГР.

3.2.1 RMSF dgFSH, FSH
15 и FSH 24 .

RMSF для трех гликоформ ФСГ (dgFSH, FSH 15 и FSH 24 ) показан на фиг. 6a.Средние значения RMSF на остаток для dgFSH, FSH 15 и FSH 24 составляют 1,014 Å, 0,999 Å и 1,018 Å соответственно. Это предполагает, что глобальные изменения RMSF для этих гликоформ не являются ни обширными, ни глобальными. Скорее, существуют специфические локальные изменения, которые происходят в основном в β-шпильках, P-петлях и концах обеих субъединиц ФСГ. Различия в значениях RMSF белковых фрагментов для FSH 15 и FSH 24 от таковых для dgFSH показаны на фиг. 6b.Остатки с абсолютной разницей более 0,50 Å (пунктирные линии) считались сильно колеблющимися остатками и были помечены. Существуют значительные различия для следующих остатков: Lys43 — Thr44 (область спирали FSHα), Gly70 (шпилька петли FSHβ), Lys128 — Ala131 (P-петля FSHβ) и Ser177.

Рис. 6.

(a) График, показывающий RMSF-значения атомов Cα из МД-моделирования dgFSH (зеленый), FSH 15 (NAG) (черный) и FSH 24 (NAG) (в красный).Остатки, связанные с RMSF, с отображением каждой субъединицы в виде столбца (α-субъединица: желтая полоса и β-субъединица: зеленая полоса) и однобуквенные кодовые последовательности с номерами остатков для областей, где RMSF изменяется в разумных пределах. Овальные точки над полосой показаны для потенциальных сайтов N-гликозилирования (черные и оранжевые точки для Asn52 и Asn78 на FSHα и зеленые и фиолетовые точки для Asn7 и Asn24 на FSHβ). Последовательности остатков с разумными изменениями RMSF не менее> 1,0 Å помечены внутри полосок в каждой субъединице.Ленточные модели: отображение с цветовой кодировкой усредненных профилей гибкости белка (значений RMSF) из МД-моделирования dgFSH, FSH 15 (NAG) и FSH 24 (NAG) (слева направо). Цветовая скользящая схема соответствует следующим диапазонам значений гибкости белков: красный (очень гибкий со значениями +5,00 Å), коричневый (значения +4,00 Å), желтый (+3,00 Å), зеленый (+2,00 Å), голубой. (+1.00 Å) и синий (наименее гибкий). Аминокислотные последовательности для остатков FSHα 3–92 (желтый) и FSHβ 3–107 (зеленый) показаны на нижней панели рисунка. (b) Разница значений RMSF для FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) от dgFSH. Обозначены конкретные остатки с абсолютной разницей более 0,50 Å (пунктирные линии).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g006

3.2.2 RMSF dgFSH, FSH
15 (NAG) -FSHR и FSH 24 (NAG) -FSHR.

RMSF для каждой из трех гликоформ FSH в комплексе с FSHR (dgFSH, FSH 15 (NAG) и FSH 24 (NAG)) показано на фиг. 7a.Средние значения RMSF на остаток для dgFSH, FSH 15 (NAG) и FSH 24 (NAG) составляют 0,850 Å, 0,934 Å и 0,888 Å соответственно. Различия в значениях RMSF белка для FSH 15 (NAG) и FSH 24 (NAG) от dgFSH показаны на фиг. 7b. Значительные различия существуют для следующих остатков: Ser90, Ala131, Ser177, Ser245, Gly394, Ser413, Ser417, Ala424 и Ser426.

Рис. 7.

(a) График, показывающий RMSF-значения атомов Cα из МД-моделирования dgFSH / FSH 24 (TAG) (зеленый), FSH 15 (TAG) (черный) и FSH 24 (БИРКА) (красным).Остатки, связанные с RMSF, с отображением каждой субъединицы в виде полосы (α-субъединица: желтая полоса, β-субъединица: зеленая полоса и FSHR: светло-оранжевая полоса) и однобуквенные кодовые последовательности с номерами остатков для областей, где RMSF изменяется в разумных пределах . Последовательности остатков с разумными изменениями RMSF не менее> 1,0 Å помечены внутри полосок в каждой субъединице. Ленточные модели: отображение цветовой кодировки усредненных профилей гибкости белка (значений RMSF) из МД-моделирования комплексов dgFSH, FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) FSH-FSHR (слева направо).Схема скольжения с цветовой кодировкой такая же, как на рис. 6а. Аминокислотные последовательности остатков FSHα 3–92 (желтый), FSHβ 3–107 (зеленый) и FSHR 1–241 (коричневый) показаны ниже. (b) Разница значений RMSF для FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) от dgFSH. Обозначены остатки с абсолютной разницей более 0,50 Å (пунктирные линии).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g007

3.2.3 RMSF dgFSH, FSH
15 (TAG) -FSHR и FSH 24 (TAG) -FSHR.

RMSF для трех гликоформ FSH в комплексе с FSHR (dgFSH, FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG)) показано на фиг. 8a. Средние значения RMSF на остаток для dgFSH, FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) составляют 0,85 Å, 0,90 Å и 0,98 Å соответственно. Это предполагает, что наблюдаются глобальные различия в RMSF для этих гликоформ, и конформационные эффекты варьируются в зависимости от количества TAG, связанных с белком. Более того, для комплекса FSH-FSHR средняя остаточная атомная флуктуация, по-видимому, выше в случае FSH 24 (TAG) от dgFSH и FSH 15 (TAG) с запасом 0.13 Å и 0,08 Å соответственно. Различия в значениях RMSF белка для FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) от dgFSH показаны на фиг. 8b. Существенные различия существуют для остатков: Ser17-Ile23, Val66-Phe72, Lys128-Arg132, Gly248, Asn382, Asp390, Gly394-Ser396, Leu411-Tyr414 и Thr426-Lys432.

Рис. 8.

(a) График, показывающий RMSF-значения атомов Cα из МД-моделирования dgFSH / FSH 24 (TAG) (зеленый), FSH 15 (TAG) (черный) и FSH 24 (БИРКА) (красным).Остатки, связанные с RMSF, с отображением каждой субъединицы в виде полосы (α-субъединица: желтая полоса, β-субъединица: зеленая полоса и FSHR: светло-оранжевая полоса) и однобуквенные кодовые последовательности с номерами остатков для областей, где RMSF изменяется в разумных пределах . Последовательности остатков с разумными изменениями RMSF не менее> 1,0 Å помечены внутри полосок в каждой субъединице. Ленточные модели: отображение цветовой кодировки усредненных профилей гибкости белка (значений RMSF) из МД-моделирования комплексов dgFSH, FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) FSH-FSHR (слева направо).Схема скольжения с цветовой кодировкой такая же, как на рис. 6а. Аминокислотные последовательности остатков FSHα 3–92 (желтый), FSHβ 3–107 (зеленый) и FSHR 1–241 (коричневый) показаны ниже. (b) Разница значений RMSF для FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) от dgFSH. Остатки с абсолютной разницей более 0,50 Å помечены двумя черными пунктирными линиями с отсечкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g008

3.2.4 Гибкость свободного и рецепторного ФСГ.

На рис. 9a сравниваются значения RMSF для свободных и связанных с FSHR моделей FSH, а на рис. 9b сравнивается разница между RMSF для моделей со свободным и FSH-связанным. Значительное снижение RMSF было отмечено в двух областях субъединицы FSHα с центром на остатках Met45 и Met69 и в одном участке субъединицы FSHβ с центром на остатках Lys128-Ala131. Снижение гибкости было отмечено для области с центром αMet69, а значительное снижение гибкости было связано с βLys128-Ala131.Оба участка располагались в одном и том же районе ФСГ, который образовывал связывающий карман сульфо-Tyr335. Met45 был расположен на другом конце молекулы ФСГ в αL2, который взаимодействует с рецептором. Связывание с FSHR не влияет на гибкость в двух областях рядом с аминоконцом FSHα и на C-конце FSHβ.

Рис. 9.

(a) График, показывающий RMSF-значения атомов Cα из МД-моделирования моделей свободного / несвязанного FSH и FSHr-связанного FSH. Изменения RMSF были отмечены в двух областях субъединицы FSHα с центром на остатках Met45 и Met69 и в одном участке субъединицы FSHβ с центром на остатках Lys128-Ala131.Остатки с изменениями RMSF не менее> 2,0 Å отмечены внутри полосок в каждой субъединице. (b) Разница значений RMSF для моделей FSHR-связанного и свободного-FSH. Остатки с абсолютной разницей более 1,0 Å помечены одной черной пунктирной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g009

3.3 Полная свободная энергия связи

Чтобы оценить термодинамические факторы, лежащие в основе дифференциальной аффинности связывания ФСГ в зависимости от состояния гликозилирования ФСГ, наши расчеты GBSA показывают, что возникают существенные различия в свободной энергии связывания ФСГ для разных комплексов.Рис. 10 и таблица 1 показывают, что полностью дегликозилированный ФСГ связывается с наибольшим сродством (GBTOT = общая свободная энергия связывания GBSA) с клеточным рецептором ФСГ. Меньшие гликаны NAG влияют, по крайней мере, лишь на минимальное энергетическое нарушение стабильности комплекса: общая энергия связывания для лигандов FSH 15 и FSH 24 не показывает реальной статистической разницы по сравнению с полностью дегликозилированным белком. С оговоркой, что различия в числах свободной энергии GBSA ниже порога статистической значимости, можно отметить появление умеренной возможной тенденции к снижению стабильности комплекса как функции большего гликозилирования ФСГ.Эта тенденция существенно усиливается для более крупных гликанов ТАГ, где наблюдается большое и значительное снижение стабилизации свободной энергии при сравнении дегликозилированного и частично гликозилированного состояний. Среди изоформ ТАГ такая же большая разница в аффинности связывания предсказывается при сравнении частично и полностью гликозилированного ФСГ.

Рис. 10. Энергетические компоненты (ккал / моль) для связывания FSH / FSHR в различных системах, таких как dgFSH, FSH 15 (NAG), FSH 24 (NAG), FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG): INT: внутренняя энергия, возникающая из связи, угла и двугранных членов, ELE: электростатическая энергия в газовой фазе; VDW: энергия Ван-дер-Ваальса; GBSOL: сумма полярных и неполярных энергий сольватации; GBTOT: Полная энергия связи.

Планки погрешностей, показанные сплошной черной линией, указывают разницу в стандартных отклонениях.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g010

Физико-химическое происхождение гликоформ-зависимых вариаций свободной энергии связывания довольно сложно. Два термина, перечисленных в таблице 1, на самом деле склонны к увеличению связывания как функции повышенного гликозилирования ФСГ: GBSOL (который учитывает сложные эффекты энтропии и десольватации) и энтальпийный вклад ван-дер-Ваальса (который в основном указывает на то, что более сильно гликозилированные изоформы ФСГ имеют более благоприятные неполярные контакты, чем голый FSH).И наоборот, что более важно, ковалентная энтальпия (мера внутримономерного конформационного напряжения) и компоненты электростатического взаимодействия демонстрируют сильную обратную корреляцию по сравнению с увеличением гликозилирования.

3.4 Анализ соляных мостиков

Конформационный штамм в белковых молекулах довольно сложно однозначно охарактеризовать, поскольку он часто распределяется по молекуле и может существенно изменяться в динамике. Однако более легко интерпретировать межмономерное электростатическое взаимодействие.Ключевой компонент взаимодействия FSH / FSHR опосредуется серией довольно сильных солевых мостиков (два связывают FSHα с FSHR и два между FSHβ и FSHR). Эти четыре ключевых примера изображены на фиг. 11. Как суммировано в таблице 2, способность комплекса FSH / FSHR поддерживать каждый из этих солевых мостиков значительно варьируется в зависимости от состояния гликозилирования. При сравнении полностью дегликозилированного ФСГ с ФСГ 15 (ТАГ) и ФСГ 24 (ТАГ) мы обнаруживаем, что один солевой мостик (исходящий от Asp93 на ФСГβ) сохраняет почти неизменную силу и стойкость независимо от состояния гликозилирования ФСГ, но остальные три демонстрируют ощутимые вариации.Связь между Lys51 на FSHα и Asp153 на FSHR немного слабее и менее стойкая для FSH 15 (TAG), чем в случае FSH 24 (TAG), но более существенное разрушение солевого мостика очевидно для FSH 24 (ТАГ) со значительно более слабыми и менее устойчивыми связями, происходящими от Lys91 на FSHα и от Lys40 на FSHβ.

Рис. 11. Ключевые солевые мостики на границе раздела ФСГ / ФСГР, лежащие в основе электростатических различий между ФСГ 15 (ТАГ) и ФСГ 24 (ТАГ).

FSH изображается в виде голубых лент с ключевыми остатками, показанными в виде полосок зеленого / CPK-цвета, тогда как FSHR визуализируется с помощью желтых лент и желтых / цветных полосок CPK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.g011

Таблица 2. Медианные расстояния O-N для выбранных межбелковых солевых мостиков.

Значения даны в Ангстремах, усредненные по молекулярно-динамической конформационной выборке. Значения в скобках представляют собой долю времени, в течение которой расстояние O-N меньше 3.5 Å.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137897.t002

3.5 Анализ доступной для растворителя площади поверхности (SASA)

Площадь поверхности молекулы, доступная для растворителя (SASA) — это площадь поверхности молекулы, на которую воздействует растворитель. Свободная энергия белка за счет растворителя примерно пропорциональна SASA молекулы. Гликаны в значительной степени уменьшают SASA белковой цепи в результате стерических препятствий со стороны гликановых цепей, особенно более крупных, которые могут мешать комплексообразованию.Изменение среднего значения SASA во время моделирования (начиная с первых 5 нс, когда все моделирование достаточно стабильно) для каждого остатка было рассчитано для множества различий в состоянии гликозилирования ФСГ и представлено на рисунках 12, 13 и 14. Можно видеть, что некоторые из важных остатков на границе раздела FSH-FSHR явно затруднены присутствием гликановых цепей.

3.5.1 dgFSH — FSH
15 и dgFSH — FSH 24 различия.

Как показано на фиг. 12, различия остатков в формах FSH 15 или FSH 24 белка из dgFSH выявили несколько остатков, которые вносили значительный вклад.Чтобы идентифицировать остатки с существенным вкладом в SASA, мы классифицировали все остатки, используя пороговое значение вкладов 40 Å. Остатки, такие как Asp1, Gln48, Tyr146 и Ser177, показали различия для dgFSH-FSH 15 (фиг. 12a) и остатков, таких как Gln3, Glu75, Asn95, Asn112, Lys128, Tyr146 и Ser177, для сравнения dgFSH-FSH 24 (фиг. 12б). Было обнаружено, что Tyr146 и Ser177 обнаруживают различия как в формах FSH 15 , так и в формах FSH 24 .Также их присутствие в интерфейсной области увеличивает вероятность того, что они являются важными остатками, участвующими во взаимодействии FSH-FSHR.

3.5.2 различия dgFSH — FSH
15 (NAG) -FSHR и dgFSH — FSH 24 (NAG) -FSHR.

На фиг. 13 показаны различия остатков в dgFSH-FSH 15 (NAG) и dgFSH-FSH 24 (NAG). Чтобы идентифицировать остатки со значительным вкладом в SASA, мы классифицировали все остатки, используя пороговое значение вкладов 40 Å.Остатки, такие как Tyr127, Tyr146, Ser177, Leu430, Leu433 и Thr435, Leu436 и Glu437, показали разницу более чем на 40 Å для dgFSH — FSH 15 (NAG) (фиг. 13a) и таких остатков, как Gln3, Asn95, Asn112, Lys128, Tyr146 и Lys420, Lys431, Thr435 и Leu436 для сравнения dgFSH-FSH 24 (NAG) (фиг. 13b).

3.5.3 различия dgFSH — FSH
15 (TAG) -FSHR и dgFSH — FSH 24 (TAG) -FSHR.

На фиг. 14 показаны различия между остатками в доступной для растворителя области для dgFSH — FSH 15 (TAG) и dgFSH — FSH 24 (TAG), а также выделены остатки, вносящие вклад более 40 Å для SASA.Остатки, такие как Asp1, Gln3, Pro6, Glu7, Thr9, Leu10, Gln11, Pro22, Leu24, Gln48, Asn50, Tyr121, Tyr146, Thr163, His409, Arg425, Tyr428, Lys431, Thr435 и Leu436, показали разницу более чем на 40 Å. для сравнения dgFSH-FSH 15 (TAG) (фиг. 14a), тогда как остатки, такие как Asp1, Pro22, Leu24, Lys43, Asp48, Asn78, Asn95, Thr97, Glu103, Glu104, Arg106, Phe107, Asn112, Tyr146, Pro152, Ala155, Thr163, Asn284, Asn285, Arg405, Thr427, Tyr428, Asn429 и Glu437 различают сравнение dgFSH-FSH 24 (TAG) (фиг. 14b).

Обсуждение

Доказательства физиологического существования множества гликоформ ФСГ в одном организме позволяют предположить, что биохимическая функция ФСГ зависит от гликоформы. Другими словами, вполне вероятно, что профили взаимодействия ФСГ с его родственными клеточными рецепторами будут варьироваться в зависимости от состояния гликозилирования, тем самым оказывая различное влияние на родственные пути передачи сигналов. В этом исследовании использовалось моделирование МД для проверки гипотезы [12] о том, что гипогликозилированные гликоформы ФСГ обладают наибольшей функциональной эффективностью в обеспечении репродуктивной функции у молодых женщин репродуктивного возраста.Учитывая неопределенность в отношении точных биохимических изменений, вызванных дегликозилированием на Asn7 по сравнению с Asn24 на FSHβ, в этом предварительном исследовании мы решили смоделировать профиль связывания FSH / FSHR для FSH 15 , который влечет за собой дегликозилирование на обоих сайтах FSHβ, и сравнить это поведение относительно полностью гликозилированного ФСГ 24 и полностью дегликозилированного, dgFSH. Эти симуляции были применены к конкретному вопросу о том, существует ли кинетическая или термодинамическая основа для предсказания усиленного профиля связывания для ФСГ 15 (относительно ФСГ 24 ) в его взаимодействиях с высокоаффинным участком клеточного рецептора гонадного ФСГ.

Связывание

ФСГ со своим рецептором включает три стадии [17,20]. На первом этапе ФСГ вовлекается в высокоаффинный сайт связывания, о котором известно, что он находится в богатой лейцином области повторов внеклеточного домена [7,16]. Связывание с высоким сродством запускает вторую стадию, конформационный сдвиг в связанном с рецептором ФСГ, создавая сайт связывания для высококонсервативного остатка сульфотирозина, который, как было показано, важен для активации рецептора гликопротеинового гормона [33]. Третий этап включает в себя остаток 335 сульфо-Tyr рецептора ФСГ (sTyr335), вступающий в контакт с индуцированным связыванием сайтом на ФСГ.Этот шаг был предложен для устранения ингибирующего влияния незанятого внеклеточного домена, позволяя перейти от неактивной к активной конформации в трансмембранном домене, тем самым активируя рецептор ФСГ [17,20]. Поскольку для последующих стадий необходимо связывание с высоким сродством, исследования, представленные в настоящем документе, очень важны для полного понимания вызванной ФСГ активации рецептора ФСГ. Хотя на момент начала этих исследований была доступна только кристаллическая структура 1WXD ФСГ, связанного с высокоаффинным сайтом внеклеточного домена рецептора ФСГ, они остаются актуальными, поскольку все последующие этапы, ведущие к активации рецептора ФСГ, зависят от начального высокоаффинного взаимодействия между лиганд и рецептор.Последующая кристаллическая структура ФСГ, связанного с полным внеклеточным доменом, подтвердила взаимодействие между ФСГ и рецептором ФСГ, поскольку эти взаимодействия были такими же в структуре 4AY9. Эта последняя структура выявила значимость конформационных изменений, сопровождающих связывание с высоким сродством ФСГ, что не было признано в более раннем исследовании [20].

Информация, собранная в совокупности на рисунках 4 и 5, ясно указывает на то, что, хотя разные NAG-гликоформы ФСГ, по-видимому, не проявляют значительных конформационных вариаций при связывании с ФСГ, структура ФСГ 15 (ТАГ) имеет профиль связывания ФСГР, который является вполне приемлемым. отличается от того, что наблюдается для FSH 24 (TAG).В частности, структура FSH 15 (TAG) гораздо быстрее адаптируется к силам, действующим со стороны FSHR, чем FSH 24 (TAG). Более того, при пространственном разложении структурной адаптации можно обнаружить, что релаксация FSH в непосредственной близости от интерфейса связывания FSH / FSHR существенно больше в случае FSH 15 , чем это обнаруживается для FSH 24 . В совокупности это, по-видимому, эффективно подтверждает экспериментальные данные о том, что препараты FSH 18/21 значительно быстрее связываются с FSHR, чем FSH 24 [18].

Сравнение значений RMSD для обеих моделей ФСГ, наблюдаемых в кристаллической структуре ФСГ [19], обеих моделей ФСГ в гормонсвязывающем домене ФСГ-ФСГР [16] и всех трех моделей, обнаруженных в кристаллической структуре ФСГ и внеклеточного ФСГ. domain [20] предположил прогрессирующую потерю гибкости [17]. Потеря гибкости согласуется с исследованиями диссоциации, в которых 125 I-FSH, связанный с рецептором FSH, остается связанным до 24 часов при 25 ° C в отсутствие холодного, конкурирующего FSH [34].По большей части области пониженной гибкости были связаны с областями петель шпильки. В настоящем исследовании сравнение значений RMSF показало снижение гибкости в трех областях и отсутствие изменений в двух других областях молекулы FSH. Снижение гибкости для αMet69 и βLys128-Ala131 было связано с образованием сайта связывания sTyr335. Ранее было отмечено, что изменение конформации, связанное с петлей βL2, подталкивает αL3 к αL1 [16]. Представленные здесь результаты согласуются с концепцией о том, что высокое сродство связывания с участком связывания гормона FSHR, в котором отсутствует sTyr335, создает стабильный сайт связывания для sTyr335 [20].Снижение гибкости αMet45, вероятно, связано с его положением в середине из 5 остатков, скрытых на границе раздела FSH / FSHR [16].

Наши расчеты показывают, что функциональные различия между FSH 15 и FSH 24 строго не ограничиваются ассоциативной кинетикой. Расчеты свободной энергии связывания GBSA показывают, что, хотя существует минимальное изменение ассоциативной энергии FSHR в зависимости от гликоформа FSH, когда белок украшен небольшими гликанами NAG, гораздо большее изменение энергии обнаруживается при исследовании FSH, украшенного большими гликанами TAG.В частности, свободная энергия для связывания FSH 15 с FSHR, по прогнозам, будет примерно на 1418 ккал / моль более благоприятной, чем для FSH 24 . Часть этой разницы возникает из-за большей внутримолекулярной деформации, присущей ФСГ 24 , в то время как она связана с ФСГР, основная разница возникает из-за различий в электростатическом сродстве между ФСГ и ФСГР. Большая часть этого различия может быть сведена к поведению двух специфических солевых мостиков: связывания Lys91 на FSHα с Asp150 на FSHR и связывания Lys40 на FSHβ и Asp196 на FSHR.В обоих этих случаях среднее ионное расстояние ON существенно увеличивается для связывания FSH 24 с FSHR по сравнению с прогнозом для FSH 15 , в то время как доля времени, в течение которого два ионных атома остаются в пределах умеренно сильного ассоциативного расстояния, значительно уменьшается. для FSH 24 . Эти наблюдения предоставляют четкие доказательства конформационных различий между FSH 15 и FSH 24 , которые избирательно способствуют стабильному связыванию FSHR первым по сравнению со вторым.

Может быть интересно поразмышлять о поведении среди других условий GBSA. Как упоминалось выше, при образовании комплекса с ФСГР энергия внутримолекулярной деформации ФСГ 24 (ТАГ) выше, чем ФСГ 15 (ТАГ). В дополнение к естественному термодинамическому штрафу, связанному с более высокой внутренней деформацией, вероятно, что FSH 24 (TAG) также испытывает чистый кинетический недостаток из-за необходимости при комплексообразовании двигаться дальше « вверх » вдоль потенциальной энергии. поверхность для достижения стабильного комплекса с FSHR.Два термина, в которых тенденции идут в обратном направлении (т. Е. FSH 24 (TAG) предпочтительнее по сравнению с FSH 15 (TAG)), — это энтальпия Ван-дер-Ваальса и GBSOL (которые в совокупности объясняют энтропию комплексообразования и десольватацию. энтальпия). Тот факт, что FSH 15 (TAG) и FSH 24 (TAG) демонстрируют противоположные тенденции среди электростатических и ван-дер-ваальсовых энтальпий в связи с FSHR, предполагает, что может существовать значительная диэлектрическая зависимость, влияющая на относительный FSH 15 (TAG). ) и профили связывания ФСГ 24 (ТАГ), при этом среда с низкой диэлектрической проницаемостью способствует связыванию ФСГ 15 (ТАГ), а более полярная среда благоприятствует связыванию ФСГ 24 (ТАГ).Существенная разница в GBSOL может частично возникать из-за значительной разницы в энергии сольватации между двумя гликоформами FSH, что опять же тесно связано с местной диэлектрической средой. Поскольку наше моделирование предполагало полярную водную среду, которая должна быть справедливым (но маловероятно идеальным) приближением к окружающей среде интерстициальной среды в непосредственной близости от высокоаффинного участка гонадного (или другого) рецептора ФСГ. Отличия от стандартной водной диэлектрической среды (ε = 80.4), таким образом, должно приводить к некоторому изменению предсказанных значений свободной энергии связи. И наоборот, изменения температуры могут влиять на относительную составляющую энтропии в GBSOL и, таким образом, вызывать некоторую зависимость от окружающей среды в предсказаниях свободной энергии. Однако, учитывая относительно скромные вариации GBSOL (относительно ковалентной деформации и электростатических членов), мы уверены, что проведенное нами моделирование (и предполагаемые условия его проведения) предоставляют нам разумную и сбалансированную деконволюцию свободных энергий связи.

Заключение

В конечном счете, наши данные указывают на то, что ФСГ 15 (ТАГ) имеет более благоприятный профиль связывания ФСГ, чем ФСГ 24 (ТАГ), как с кинетической, так и с термодинамической точки зрения. Получение относительного веса для этих двух факторов, чтобы определить, явно ли доминирует какой-либо из наблюдаемых различий в поведении связывания, можно было бы продолжить с помощью исследований, изучающих эффекты изменения температуры, но выходящие за рамки этого предварительного исследования.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом NIH P01 AG-029531, предоставленным GRB.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: BRM GRB GHL. Проведены эксперименты: БРМ АД. Проанализированы данные: BRM AD GRB GHL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: BRM AD GRB GHL. Написал статью: BRM AD GRB GHL.

Ссылки

  1. 1. Варки А. (1993) Биологическая роль олигосахаридов: все теории верны.Гликобиология 3: 97–130. pmid: 84

  2. 2. Янкович М. (2011) Гликаны как биомаркеры: состояние и перспективы. Журнал медицинской биохимии 30: 213–223.
  3. 3. Шентал-Бехор Д., Леви Ю. (2008) Эффект гликозилирования на сворачивание белка: пристальный взгляд на термодинамическую стабилизацию. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 105: 8256–8261. pmid: 18550810
  4. 4. Calvo FO, Keutmann HT, Bergert ER, Ryan RJ (1986) Дегликозилированный человеческий фоллитропин: характеристика и влияние на выработку аденозинциклического 3 ‘, 5’-фосфата в клетках гранулезы свиней.Биохимия 25: 3938–3943. pmid: 3017410
  5. 5. Bishop LA, Robertson DM, Cahir N, Schofield PR (1994) Конкретные роли связанных с аспарагином углеводных остатков рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека в связывании рецептора и передаче сигнала. Мол эндокринол 8: 722–731. pmid: 7935488
  6. 6. Flack MR, Froehlich J, Bennet AP, Anasti J, Nisula BC (1994) Сайт-направленный мутагенез определяет индивидуальные роли сайтов гликозилирования на фолликулостимулирующем гормоне.J Biol Chem 269: 14015–14020. pmid: 8188681
  7. 7. Дэвис Д., Лю X, Сегалофф Д.Л. (1995) Идентификация участков N-связанного гликозилирования на рецепторе фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и оценка их роли в функции рецептора ФСГ. Молекулярная эндокринология 9: 159–170. pmid: 7776966
  8. 8. Уолтон В.Дж., Нгуен В.Т., Бутнев В.Ю., Сингх В., Мур В.Т., Боусфилд Г.Р. и др. (2001) Характеристика изоформ человеческого ФСГ выявляет негликозилированную бета-субъединицу в дополнение к обычной гликозилированной бета-субъединице.Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 86: 3675–3685. pmid: 11502795
  9. 9. Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, Nayudu P (2003) Влияние углеводной гетерогенности на функцию фолликулостимулирующего гормона: исследования, полученные на моделях in vitro и in vivo. Биология размножения 69: 379–389. pmid: 12700183
  10. 10. Boime I (2004) Одноцепочечные гликозилированные или негликозилированные гормоны фертильности с различной активностью ФСГ или ЛГ.Патент США. США.
  11. 11. Mizunuma H (2011) Старение яичников и болезни обмена веществ. Сайшин Игаку 66: 862–867.
  12. 12. Дэвис Дж. С., Кумар Т. Р., Мэй Дж. В., Боусфилд Г. Р. (2014) Варианты гликозилирования естественного фолликулостимулирующего гормона. Журнал гликомики и липидомики 04: e117.
  13. 13. Боусфилд Г.Р., Бутнев В.Ю., Уолтон В.Дж., Нгуен В.Т., Хунейди Дж., Сингх В. и др. (2007) N-гликозилирование по принципу «все или ничего» в бета-субъединицах фолликулостимулирующего гормона приматов.Молекулярная и клеточная эндокринология 260–262: 40–48. pmid: 17079072
  14. 14. Харви Д. Д., Мерри А. Х., Ройл Л., Кэмпбелл М. П., Двек Р. А., Радд П. М. и др. (2009) Предложение по стандартной системе для построения структурных диаграмм N- и O-связанных углеводов и родственных соединений. Протеомика 9: 3796–3801. pmid: 19670245
  15. 15. Harvey DJ, Merry AH, Royle L, Campbell MP, Rudd PM (2011) Номенклатура символов для представления гликановых структур: расширение для охвата различных типов углеводов.Протеомика 11: 4291–4295. pmid: 21954138
  16. 16. Fan QR, Hendrickson WA (2005) Структура человеческого фолликулостимулирующего гормона в комплексе с его рецептором. Природа 433: 269–277. pmid: 15662415
  17. 17. Jiang X, Dias JA, He X (2014) Структурная биология гликопротеиновых гормонов и их рецепторов: понимание передачи сигналов. Молекулярная и клеточная эндокринология 382: 424–451. pmid: 24001578
  18. 18. Боусфилд Г. Р., Бутнев В. Ю., Хиромаса Ю., Харви Д. Д., Май СП (2014) Гипогликозилированный фолликулостимулирующий гормон человека (чФСГ (21/18)) намного более активен in vitro, чем полностью гликозилированный чФСГ (чФСГ (24)) .Молекулярная и клеточная эндокринология 382: 989–997. pmid: 24291635
  19. 19. Fox KM, Dias JA, Van Roey P (2001) Трехмерная структура фолликулостимулирующего гормона человека. Молекулярная эндокринология 15: 378–389. pmid: 11222739
  20. 20. Jiang X, Liu H, Chen X, Chen PH, Fischer D, Sriraman V и др. (2012) Структура фолликулостимулирующего гормона в комплексе со всем эктодоменом его рецептора. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 109: 12491–12496.pmid: 22802634
  21. 21. SYBYL 8.1 (2008) Tripos Inc., Сент-Луис, Миссури, США.
  22. 22. GLYCAM-Web (2005–2014) Woods Group. Центр исследования сложных углеводов, Университет Джорджии, Афины, Джорджия. (http://www.glycam.com).
  23. 23. Дело DA, Cheatham TE, Darden T., Gohlke H, Luo R, Merz KM и др. (2005) Программы биомолекулярного моделирования Amber. Журнал вычислительной химии 26: 1668–1688. pmid: 16200636
  24. 24. Хорнак В., Абель Р., Окур А., Строкбайн Б., Ройтберг А., Симмерлинг С. и др.(2006) Сравнение нескольких янтарных силовых полей и разработка улучшенных параметров белкового остова. Белки 65: 712–725. pmid: 16981200
  25. 25. Киршнер К.Н., Йонге А.Б., Чампель С.М., Гонсалес-Отейрино Дж., Дэниэлс С.Р., Фоли Б.Л. и др. (2008) GLYCAM06: обобщаемое биомолекулярное силовое поле. Углеводы. Журнал вычислительной химии 29: 622–655. pmid: 17849372
  26. 26. Йоргенсен В.Л., Чандрасекхар Дж., Мадура Дж. Д., Импей Р.В., Кляйн М.Л. (1983) Сравнение простых потенциальных функций для моделирования жидкой воды.Журнал химической физики 79: 926–935.
  27. 27. Йоргенсен В.Л., Мадура Дж.Д. (1985) Зависимость от температуры и размера для моделирования воды Tip4p методом Монте-Карло. Молекулярная физика 56: 1381–1392.
  28. 28. Филлипс Дж. К., Браун Р., Ван В., Гамбарт Дж., Тайхоршид Е., Вилла Е. и др. (2005) Масштабируемая молекулярная динамика с NAMD. Журнал вычислительной химии 26: 1781–1802. pmid: 16222654
  29. 29. Эссманн У., Перера Л., Берковиц М.Л., Дарден Т., Ли Х., Педерсен Л.Г. и др.(1995) Метод Эвальда с сеткой из гладких частиц. Журнал химической физики 103: 8577–8593.
  30. 30. Ryckaert JP, Ciccotti G, Berendsen HJC (1977) Численное интегрирование декартовых уравнений движения системы с ограничениями — молекулярная динамика N-алканов. Журнал вычислительной физики 23: 327–341.
  31. 31. Миямото С., Коллман П.А. (1992) Оседание — аналитическая версия алгоритма встряхивания и погремушки для моделей с жесткой водой. Журнал вычислительной химии 13: 952–962.
  32. 32. Массова И., Коллман П.А. (2000) Комбинированный молекулярно-механический подход и подход с непрерывным растворителем (MM-PBSA / GBSA) для прогнозирования связывания лиганда. Перспективы открытия и дизайна лекарств 18: 113–135.
  33. 33. Bonomi M, Busnelli M, Persani L, Vassart G, Costagliola S (2006) Структурные различия в шарнирной области рецепторов гликопротеинового гормона: данные по сульфатированным остаткам тирозина. Мол эндокринол 20: 3351–3363. pmid: 16

    0

  34. 34.Cheng KW (1975) Свойства рецептора фолликулостимулирующего гормона в клеточных мембранах яичка крупного рогатого скота. Biochem J 149: 123–132. pmid: 242318

Моделирование уровней фолликулостимулирующих гормонов в сыворотке для контролируемой гиперстимуляции яичников III: улучшенное введение гонадотропинов

Название: Моделирование уровней фолликулостимулирующих гормонов в сыворотке для контролируемой гиперстимуляции яичников III: Улучшенное введение гонадотропинов

ОБЪЕМ: 13 ВЫПУСК: 3

Автор (ы): Дэвид Х.Маккалох, Хосе М. Колон и Питер Г. Макговерн

Место работы: University Reproductive Associates, 214 Terrace Avenue. Хасбрук-Хайтс, штат Нью-Джерси, США.

Ключевые слова: Контролируемая гиперстимуляция яичников, фармакокинетика ФСГ, введение гонадотропинов, фармакокинетические параметры, сыворотка, математическая модель, клинический индекс, асимптотические пределы, фолликулостимулирующий гормон, методы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), поликистоз синдром яичников, пациенты с гиперответчиком, модельная среда, стимуляция яичников

Резюме: Предпосылки: численная модель с двумя фармакокинетическими параметрами (скорость диффузии в кровь (τin) и скорость исчезновения из крови (τout)) имитирует медленные изменения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), наблюдаемые в сыворотка.Часто требуется более быстрое изменение уровня ФСГ в сыворотке. Поскольку фармакокинетические параметры не могут быть изменены у пациентов, мы использовали модель для исследования изменения количества и времени введения гонадотропина для более быстрого изменения уровня ФСГ в сыворотке крови. Методы: Параметры, определяющие модель, были получены, как описано ранее [1]. Вводимые дозы и время приема определялись индивидуально. Результаты. Повышение уровня ФСГ в сыворотке было более быстрым при введении начальной инъекции большего размера, чем последующие инъекции.Когда было желательно быстрое снижение сывороточного ФСГ, введение новой, более низкой дозы откладывали. Заключение. Использование модели, моделирующей уровни ФСГ в сыворотке во время введения гонадотропина, дало основу для изучения того, как быстрее достичь желаемых уровней ФСГ в сыворотке крови у пациентов. Зная τin и τout конкретного пациента, оптимальное введение ФСГ для этого пациента может быть определено путем моделирования.

Влияние возраста на беременность при экстракорпоральном оплодотворении опосредовано антимюллеровым гормоном (АМГ) и изменено фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) | BMC по беременности и родам

Отбор пациентов

Ретроспективный когортный анализ был проведен с использованием базы данных электронных медицинских карт eIVF, разработанной PracticeHwy.com (Даллас, Техас). Набор данных, который мы получили, состоял из 144044 цикла, извлеченных из 60 различных центров ЭКО в США с 2000 по 2016 год. Информация, записанная в базе данных eIVF для каждого цикла, включала характерный числовой идентификатор пациента, возраст пациента в начале цикла, дату ооцита. извлечение, статус цикла, исход цикла, AMH, FSH, эстрадиол, а также другие 80 переменных. Наша работа включала неидентифицированный набор данных eIVF и была признана освобожденной от проверки Институциональным наблюдательным советом больницы для женщин и младенцев Род-Айленда.

Поскольку оценка AMH не получила широкого распространения в клинической практике до 2010 года, циклы до 2010 года были исключены из-за отсутствия значений AMH. Все циклы с отсутствующей или неполной информацией были исключены, а также были выбросы по определенным переменным, таким как возраст, номер цикла, общее количество извлеченных ооцитов, количество 2PN, количество фолликулов, значение E2, AMH и FSH. Центры, которые имели менее 10 циклов, были признаны ненадежными, поэтому были удалены.Таким образом, окончательный набор данных содержал 13790 циклов аутологичного ЭКО с известными значениями AMH, FSH и подтвержденной информацией о живорождении или нет. Подробности о критериях включения и исключения исследования были задокументированы в виде блок-схемы на рис. 1 в предыдущей статье [24] и в наших дополнительных материалах.

Рис. 1

Причинно-следственные диаграммы с возрастом в качестве воздействия, AMH или FSH в качестве посредника и живорождением в качестве результата

Статистические методы

Для наблюдения за предельными эффектами возраста, AMH и FSH, серия логистических Модели со смешанным эффектом использовались для исследования связи живорождения и AMH (или FSH) с поправкой на возможные факторы, влияющие на факторы: возраст, индекс массы тела (BMI) и случайные эффекты центров, а также с учетом взаимодействия между возрастом, AMH и FSH .Случайные эффекты центров были включены для учета неоднородности по многочисленным центрам.

На рисунке 1 показаны две причинно-следственные диаграммы, которые изображают прямой (синий) и косвенный (красный) эффекты в модели посредничества. Один с AMH, другой с FSH в качестве посредника; как с возрастом, так и с рождением живого ребенка в результате. Чтобы соответствовать модели с одним медиатором, которую мы разработали на основе методов оценки опосредованного эффекта как дихотомического медиатора, так и результата [23], мы преобразовали исходные непрерывные значения AMH и FSH в дихотомические значения, чтобы отразить их клиническую значимость: AMH менее 1 .0 нг / мл и ФСГ менее 10 мМЕ / мл считались нулевыми; ФСГ больше или равный 10 мМЕ / мл и значения АМГ больше или равные 1,0 нг / мл считались 1 с. Затем мы рассчитали отношения рисков (RR) и доверительные интервалы (CI) прямых эффектов (DE) и косвенных эффектов (IE) через AMH и FSH с учетом и без корректировки взаимодействия с возрастом, используя метод начальной загрузки и модели посредничества. мы предложили. Мы сообщили о прямом и косвенном влиянии на шкалу отношений риска (ОР), сравнивая уровень живорождений у женщин в возрасте 39 лет (3-й квантиль) и 32 (1-й квантиль).

Дополнительный анализ медиации был проведен с циклами, сгруппированными на основе пороговых значений, полученных нами при использовании квинтилей ФСГ (Q1 = 5,1, Q2 = 6,5, Q3 = 7,7, Q4 = 9,7 мМЕ / мл). Модели посредничества были применены к каждой группе по уровню ФСГ, чтобы определить прямое и косвенное влияние возраста на живорождение по отношению к АМГ. Кроме того, чтобы учесть нелинейный эффект возраста, циклы также были сгруппированы по возрасту пациентов: все возрасты были округлены до ближайшего целого числа, в то время как пациенты моложе 30 лет считались 30, а пациенты старше 40 лет. возраста считались 40.Путем сортировки циклов на основе их FSH и возраста мы получили матрицу 5 на 11, каждая единица в матрице содержала циклы с FSH и возрастом при определенных пороговых значениях. Первая группа из 55 с наименьшим значением ФСГ (<5,1 мМЕ / мл) и возрастом (<30 лет) была определена как контрольная группа. Анализ посредничества был проведен в остальных 54 группах по сравнению с эталоном, чтобы определить прямые эффекты, косвенные эффекты и опосредованные пропорции. Пропорция опосредованного воздействия была определена как доля косвенного эффекта в общих эффектах; более конкретно, логарифмические отношения рисков косвенного эффекта, деленные на сумму логарифмических соотношений рисков прямого воздействия и логарифмических соотношений рисков косвенного воздействия.

Исследователи Mount Sinai разработали первое в своем классе гуманизированное антитело, нацеленное на кости и жир

Старший автор : Моне Заиди, доктор медицины, доктор философии, MACP, директор программы Mount Sinai Bone и профессор медицины (эндокринология, диабет и болезни костей) в Медицинской школе Икана на горе Синай.

Итог: Лечение ожирения и остеопороза может быть на горизонте, поскольку исследователи Mount Sinai разработали первое в своем классе гуманизированное антитело к фолликулостимулирующему гормону (ФСГ), которое уменьшит жировые отложения и увеличит костную массу. , повысить метаболизм и снизить уровень холестерина.Антитело может предотвращать и лечить ожирение, остеопороз и гиперхолестеринемию — заболевания, от которых страдают миллионы женщин и мужчин во всем мире. Исследование обеспечивает основу для клинического тестирования гуманизированного антитела.

Результаты: Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) на протяжении многих лет считался важной частью репродуктивной системы. Но новаторские исследования показали на мышиной модели, что ФСГ также играет прямую роль в потере костной массы и увеличении жира на животе, и что блокирование ФСГ полностью изменит эти эффекты.В самом последнем исследовании исследователи объясняют разработку «гуманизированного» моноклонального антитела для блокирования передачи сигналов ФСГ. Кроме того, были обнаружены новые доказательства того, что блокирование ФСГ также снижает уровень холестерина в сыворотке.

Почему исследование интересно: Ожирение и остеопороз поражают почти 650 миллионов и 200 миллионов человек во всем мире. Однако ресурсы для профилактики и лечения этих расстройств остаются ограниченными, особенно по сравнению с эпидемиями общественного здравоохранения аналогичного масштаба.Это гуманизированное антитело против ФСГ может предотвращать и лечить не одно, а три заболевания — ожирение, остеопороз и гиперхолестеринемию.

Who : Становится все более очевидным, что ожирение и остеопороз клинически взаимосвязаны. Женщины в период менопаузы теряют кости и набирают жир. Уровень ФСГ, повышающийся в период менопаузы, может быть причиной увеличения веса и потери костной массы, с которыми сталкиваются многие женщины в среднем возрасте.

What : Исследование FSH основано на долгосрочном сотрудничестве, охватывающем почти два десятилетия, между доктором Дж.Заиди и Клиффорд Розен, доктор медицины, старший научный сотрудник Исследовательского института Медицинского центра штата Мэн. Результаты их предыдущей работы были опубликованы в журнале Nature в 2017 году и вошли в число восьми «заметных достижений» в биомедицине, названных в том году журналом Nature Medicine. Данные на основе мыши, доктор. Заиди и Розен, одновременно подтвердившие в лабораториях друг друга, показали, что блокирование ФСГ снижает ожирение и увеличивает расход энергии как у самцов, так и у самок мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров.Самое последнее исследование показывает гуманизацию этого антитела, блокирующего ФСГ.

Название статьи: Первое в своем классе гуманизированное антитело, блокирующее ФСГ, нацелено на кости и жир

Журнал: Труды Национальной академии наук

Сказал доктор Моне Заиди из Mount Sinai:

«Этот следующий этап еще больше приближает нас к эффективной терапии блокирующими ФСГ антителами, направленной на предотвращение и лечение ожирения и остеопороза.В прошлых исследованиях было обнаружено, что нацеливание и блокирование ФСГ эффективны как у самцов, так и у самок мышей, поэтому его преимущества могут распространяться на людей обоих полов. Что было бы увлекательно и невероятно полезно, если бы мы действительно смогли показать значительное увеличение продолжительности жизни, регулируя ожирение и остеопороз с помощью одного агента, блокирующего ФСГ ».

###

Исследователи разработали первые в своем классе гуманизированные антитела, нацеленные на кости и жир

Лечение ожирения и остеопороза может быть на горизонте, поскольку исследователи Mount Sinai разработали первые в своем классе гуманизированные антитела против фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), который уменьшает жировые отложения, увеличивает костную массу, улучшает обмен веществ и снижает уровень холестерина.Антитело может предотвращать и лечить ожирение, остеопороз и гиперхолестеринемию — заболевания, от которых страдают миллионы женщин и мужчин во всем мире. Исследование обеспечивает основу для клинического тестирования гуманизированного антитела.

Исследователи под руководством Моне Заиди, доктора медицины, доктора философии, MACP, директора программы Mount Sinai Bone Program и профессора медицины в Медицинской школе Икана на горе Синай, отмечают, что, хотя ожирение и остеопороз затрагивают сотни миллионов людей во всем мире, ресурсы предотвращение этих заболеваний остается ограниченным.

В течение многих лет было известно, что ФСГ является важной частью репродуктивной системы. Но исследования показали на мышиной модели, что ФСГ также играет прямую роль в потере костной массы и увеличении жира на животе, и что блокирование ФСГ полностью изменит эти эффекты. В самом последнем исследовании исследователи объясняют разработку «гуманизированного» моноклонального антитела для блокирования передачи сигналов ФСГ. Кроме того, были обнаружены новые доказательства того, что блокирование ФСГ также снижает уровень холестерина в сыворотке.

Исследование ФСГ основано на долгосрочном сотрудничестве, охватывающем почти два десятилетия, между Заиди и Клиффордом Розеном, доктором медицины, старшим научным сотрудником Исследовательского института Медицинского центра штата Мэн.Данные на мышах, которые Заиди и Розен одновременно подтвердили в лабораториях друг друга, показали, что блокирование ФСГ снижает ожирение и увеличивает расход энергии как у самцов, так и у самок мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров.